丛枝菌根真菌(AMF)接种剂种类和接种时期对牡丹菌根化组培苗培养的影响

曾端香，袁 涛，王莲英

（1国家林业和草原局管理干部学院，北京 102600；2北京林业大学园林学院，北京 100083）

0 引言

据报道80%以上的植物具有丛枝菌根(AM)共生体系，Cronquist统计90%的维管植物都能形成丛枝菌根。丛枝菌根真菌(AMF)不仅对植物的生长发育、营养状况、抗逆性以及产量与品质等具有重要作用，并且在一定程度上改良土壤质地、减少土壤病害、减轻环境污染[1-7]。郭邵霞[8]通过对河南洛阳和山东菏泽地区的栽培牡丹根围的AMF资源调查，发现AMF是牡丹上普遍存在的现象。

组织培养已经成为园艺园林植物产业化生产的重要环节和快速繁殖苗木的主要形式。组织培养是在无菌条件下进行的，因而种苗与菌根真菌接触的机会大为减少，甚至到了苗圃驯化培育阶段也还常得不到菌根真菌的帮助，导致苗木生长状况较差，抵抗力较弱，成活率较低[9]。张桂花[10]以牡丹品种‘黑花魁’、‘豆绿’等的休眠芽为外植体进行组培研究，但没有获得生根苗；陈怡平等[11]以牡丹不同的器官为外植体，通过不同的途径获得了不定芽，但不定芽生根困难。牡丹组培中仍存在组培苗生根难、褐化和玻璃化现象严重、移栽阶段植株感病严重和死亡率高等问题[12-14]，成为了牡丹组培的瓶颈。曾端香等[15]对牡丹2个杂交系进行胚培养得到胚根苗无菌体系，筛选出胚培养最佳培养基和培养条件组合，通过牡丹胚培养解决组培中褐化问题，缩短繁育周期[16-18]。Pieriek[19]认为菌根生物技术在克服组培苗逆境胁迫方面，向根际引入有益微生物是一种重要机制，由于组培植株生长在一个完全无菌的环境中，因此尽早对组培苗进行高效菌根真菌的人工接种，实现种苗菌根化，可减轻移栽对组培苗造成的胁迫并能在移栽或定植后发挥功能[20]，成为人们研究的热点。接种AMF还可以抑制组培苗在未消毒土壤中被土传病原菌侵染，所以在种苗生产上，培育菌根化脱毒苗将会成为发展趋势[21-22]。Fortuna[23]对红叶李组培苗、李敏等[24]对芋组织培养苗、任萌圃等[25]对金叶连翘组培苗在移栽阶段接种AMF，可提高组培苗的移栽成活率；曾端香等[26-27]发现接种AMF可以显著改善牡丹菌根化容器苗对矿质营养元素的吸收和促进其生长发育。

本研究对牡丹组培苗在瓶内和移栽时接种不同种类的AMF，探索AMF对组培苗菌根化侵染过程和对组培苗移栽成活率和生长发育等的影响，以期为培养牡丹菌根化组培苗提供实践途径和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试AMF菌种 由北京市农林科学院中国丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)提供，菌种1#为Glomus geosporum，BGC 507(GZ-01)；菌 种 2#为Glomus mosseae，BGC(XJ-01)。

1.1.2 供试植物材料 牡丹组培苗为组培试验中‘乌龙捧盛’的休眠芽组培的根诱导苗和生根苗，以及‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’的胚培养的胚根苗。2月下旬—3月初分别从北京植物园牡丹园和北京回龙观牡丹园采集牡丹休眠芽进行组培以获得根诱导苗和生根苗，10—11月从牡丹芍药育种基地（河南）采集杂交牡丹种子进行胚培养以获得胚培养的胚根苗。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌条件下牡丹组培苗瓶内接种AMF试验

（1）AMF孢子分离提取。用湿筛倾析法分离孢子，在体视解剖镜下挑取大小一致、不带连孢菌丝的孢子备用。

（2）AMF孢子的表面灭菌方法。参照董昌金[28]的差别灭菌法。①先用A液（2%氯胺-T+200 mg/L链霉素+100 mg/L庆大霉素）处理10 min，无菌水冲洗数次；②置于25～27℃培养3天，让杂菌萌发；③再用A液灭菌10 min后无菌水冲洗，即重复步骤①。

（3）无菌条件下瓶内接种AMF孢子。将表面灭菌处理后的孢子进行瓶内接种。休眠芽组培苗分成未进行根诱导的休眠芽增殖芽、完成根诱导的休眠芽增殖芽、已经生根的休眠芽增殖芽3种类型接种。胚培养苗根据根长不同时期接种。将AMF孢子接种到瓶内组培苗茎段基部或根系附近，自然光培养。每株接种4～6个孢子，每处理15～20瓶，重复3次。每周观察统计孢子侵染和萌发情况以及组培苗生长情况1次。

1.2.2 牡丹组培苗移栽时接种AMF试验 移栽基质用草炭:珍珠岩=1:1的混合基质，有机质含量0.82%、可溶性氮含量24.46%、速效磷含量15.97 mg/L、速效钾含量47.91 mg/L，pH 7.15，基质经高温高压(121℃，2 h)蒸汽灭菌后晾干7天后使用。

瓶内未接种的组培苗在移栽上盆时，先在盆中装入1/3～1/2的基质，然后把AMF菌剂铺上，放上植株，舒展根系使之与菌剂全面接触，再填上基质。接种AMF菌种 1#Glomusgeosporum（简称 Gg）、菌种2#Glomusmosseae（简称Gm）及菌种1#和2#等比例混合的Glomusgeosporum+Glomusmosseae（简称Gg+Gm），其中不同接种剂用量以含相同孢子数量为原则来设计，每钵接种2～4 g菌剂，对照(CK)处理每钵加入等重的经121℃灭菌2 h的相应河沙。分别于移栽后1个月、2个月和6个月统计成活率。

1.2.3 菌根侵染指标测定 按照文献[29-30]的墨水醋染色法进行根段染色制片，按Abbott[31]的方法测定菌丝长度，在Olympus显微镜100～400倍下观察各制片中根段菌根的侵染情况，根据每条根系菌根结构的多少，按表1的分级标准记录并计算。

表1 菌根侵染分级标准

式中，n5表示5级侵染的根段数，n4表示4级侵染的根段数，n3表示3级侵染的根段数，以此类推。

1.2.4 统计分析 采用DPS专业版统计软件进行数据统计和分析，并采用Duncan进行多重比较和方差分析。

2 结果与分析

2.1 组培苗的瓶内AMF接种时期选择

本研究采用董昌金[28]的差别灭菌法进行AMF孢子表面灭菌，然后分别对牡丹组培苗进行瓶内接种AMF。由表2得出，‘乌龙捧盛’根长2 cm以上的组培苗接种AMF，其侵染率、侵染强度、生根率、平均根长和平均根数均极显著地高于其他处理，根长和根数分别比对照增长了49.29%和46.99%；对已经完成根诱导的组培苗的生根率和根的生长量有显著的增效作用，其生根率比对照提高了18.27个百分点、根长增加了26.67%、根数增加了26.16%；对未完成根诱导的组培苗的生根无效，AMF不能促进不定根的诱导。

表2 ‘乌龙捧盛’休眠芽组培苗瓶内接种AMF时期选择

由表3可看出，给‘Z1-10-3’不同生长阶段的胚根苗接种AMF，其侵染率和侵染强度均极显著(P=0.01)高于对照，各阶段的胚根苗未接种AMF的对照均没有侵染，胚根苗Ⅰ、胚根苗Ⅱ、胚根苗Ⅲ接种AMF的侵染率分别为35.23%、67.20%和90.25%，侵染强度分别为9.21、18.05和30.33，它们之间存在极显著差异，其中根长≥2.0 cm的胚根苗Ⅲ此时期接种AMF的侵染率和侵染强度最高，极显著优于其他处理。因此，选择该时期接种效果最好。

表3 ‘Z1-10-3’胚培养苗瓶内接种AMF时期选择

2.2 瓶内接种不同种类AMF对牡丹组培苗菌根侵染的影响

菌根真菌对宿主植物虽然没有表现出严格的专一性，但却对宿主植物具有一定的选择性[6]。由表4得出，‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’组培苗瓶内接种AMF均能实现侵染，而未接种的对照均没有侵染；另外，不同品种的组培苗瓶内接种同一种AMF，其侵染率和侵染强度不同，而同一品种接种不同种类的AMF，其侵染率和侵染强度也不同。对于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接种的侵染率最高，达93.12%，极显著(P=0.01)高于单一接种剂Gg和Gm，同时Gm的侵染率也极显著地高于Gg的侵染率(65.45%)；Gg+Gm的侵染强度最高为31.23，与Gm之间没有显著性差异，但均极显著高于Gg和对照。

表4 AMF种类对牡丹组培苗菌根侵染的影响

对于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率和侵染强度最高，分别为95.96%和33.33，均极显著(P=0.01)高于单一接种剂Gg和Gm，Gg的侵染率和侵染强度均极显著地大于Gm。与‘Z1-10-3’的表现相反。‘乌龙捧盛’接种Gg的侵染率和侵染强度均最高，与Gg+Gm之间没有显著性差异，但极显著大于Gm处理和对照；Gm的处理极显著优于对照。

以上试验发现，不同的AMF对不同牡丹品种的侵染率和侵染强度存在显著性差异。AM菌根是牡丹上普遍存在的现象，AM菌根的自然侵染率因品种、立地条件而异，在牡丹根围发现Glomus属大量存在，是牡丹的优势菌种，其中地球囊霉Glomusgeosporum和摩西球囊霉Glomusmosseae的寄主牡丹品种为‘凤丹’、‘乌龙捧盛’、‘洛阳红’和‘赵粉’等[8]。试验发现杂交牡丹‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’也表现出了对AMF较高的侵染率和侵染强度，它们与混合菌种的共生关系最强。

2.3 AMF对牡丹组培苗移栽成活率的影响

从表5得出，接种AMF可以提高牡丹组培苗的移栽成活率，尤其是提高移栽初期的成活率，在移栽1个月时，瓶内提前接种侵染的组培苗移栽成活率最高达91.08%，极显著(P=0.01)高于移栽时接种处理的成活率66.28%，因为移栽初期AMF侵染根系需要一定时间，在此之前没有菌根的帮助成活率降低；移栽时接种AMF的处理又极显著高于对照；在2个月和6个月时其变化趋势基本一致，但在后期对成活率的降低有所减缓，在移栽生长6个月时，瓶内接种侵染之后移栽的、移栽时接种的和对照其成活率分别为86.16%、63.36%和40.28%，它们之间存在极显著差异；瓶内接种AMF的组培苗移栽生长6个月时其成活率比对照提高了45.88个百分点。

表5 接种AMF对牡丹组培苗移栽成活率的影响

3 结论

（1）瓶内接种AMF能有效地完成侵染过程，最佳接种时期是组培苗根长≥2.0 cm时接种。‘乌龙捧盛’根长2 cm以上的组培苗接种AMF，其侵染率、侵染强度最高，极显著高于其他处理，分别比对照增长49.3%和39.4%；在未完成根诱导状态下接种AMF无效，AMF不能促进不定根的诱导，但对已经完成根诱导的组培苗的生根率和根的生长量有显著的增效作用。‘Z1-10-3’胚根苗Ⅲ（根长≥2.0 cm）接种AMF(Gm)的侵染率均极显著优于胚根苗Ⅱ（0.5 cm≤根长≤1.0 cm）、胚根苗Ⅰ（根长≤0.5 cm）和对照。同时在试验中10天内就观测到了AM菌根的侵染。

（2）瓶内不同种类AMF接种对组培苗AMF侵染有显著的影响。对于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接种的侵染率最高，达93.12%，极显著(P=0.01)高于单一接种剂Gg和Gm；其侵染强度也最高(31.23)，但与Gm之间没有显著差异，均极显著高于Gg和对照。对于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率和侵染强度最高，均极显著(P=0.01)高于单一接种剂Gg和Gm，Gg的侵染率和侵染强度均极显著大于Gm，与‘Z1-10-3’的表现相反。‘乌龙捧盛’接种Gg的侵染率和侵染强度均与Gg+Gm之间没有显著差异，但极显著大于Gm处理和对照。

（3）接种AMF且尽早接种更有利于提高移栽成活率，在移栽6个月时，瓶内接种AMF的比不接种AMF的对照提高成活率45.88个百分点。在移栽生长6个月时统计，瓶内接种AMF侵染之后移栽的、移栽时接种AMF的和对照CK，其成活率分别为86.16%、63.36%和40.28%。

4 讨论

组织培养是在无菌条件下进行的，因而种苗与菌根真菌接触的机会大为减少，甚至到了苗圃驯化培育阶段也还常得不到菌根真菌的帮助，导致苗木生长状况较差，成活率较低[9]。同时，由于在人工控制的条件下长期培养或由于培养基中外源激素的加入，组培苗丧失了调节生长素和细胞分裂素代谢的能力，这种代谢干扰在组培苗出瓶后继续存在[32]。本试验对牡丹组培苗瓶内接种后移栽和移栽时接种AMF，发现其能顺利实现侵染，接种AMF且尽早（瓶内）接种AMF更有利于提高移栽成活率，比不接种对照提高成活率45.88个百分点，与尽早对组培苗进行高效菌根真菌的人工接种、实现种苗菌根化、减轻移栽对组培苗造成的胁迫、提高组织培养苗的移栽成活率[9,33]的结论一致。

本试验发现，组培苗根长2 cm以上时为AMF接种的最佳时机，这可能是根的发育状态对AMF的侵染敏感性有影响。未完成根诱导状态下接种AMF无效，AMF不能促进不定根的诱导，但对已经完成根诱导的组培苗的生根率和根的生长量有显著的增效作用，其生根率比对照提高了18.27个百分点，因为AM菌根是根系与AMF建立的共生体，没有根系缺少寄主，共生关系将无法建立。

本试验发现，不同牡丹品种对AMF的专一性选择不同，‘乌龙捧盛’接种Gg的侵染率和侵染强度均最高，‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’的Gg+Gm处理侵染率和侵染强度最高，Gg对‘Z1-WM’比Gm强，而‘Z1-10-3’的表现相反。这可能与不同牡丹品种的优势菌种不同有关。同时，AMF侵染根系提高了组培苗的移栽成活率，促进了生长发育和矿质营养元素的吸收，缩短了育苗进程，与前人研究[27,34-36]结论一致。

AM真菌在工厂化育苗、抗旱和抗病等抗性方面的功能和促进高产稳产等方面具有较大的发展优势[26,37]。AM真菌在牡丹菌根化组培苗育苗和生产栽培上的应用大有潜力，希望扩大牡丹供试品种范围、优化AM真菌接种剂组合，进一步研究AM真菌对牡丹组培苗的生长发育的影响及其作用机理。