赭曲霉毒素A的研究进展

张 太， 毛 丹， 王少敏， 周 恒， 刘贤贤， 季 申*1，

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海市食品药品检验所，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203)

1 引言

赭曲霉毒素是赭曲霉属和几种青霉属真菌产生的一种毒素，其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)毒性最大。OTA主要由淡褐曲霉属、硫磺色曲霉属、菌核和蜂蜜味曲霉属等产生。OTA广泛存在于各种食物中，能够污染小麦、花生、啤酒等多种产品。研究发现肾脏是OTA诱导毒性的主要的靶器官，但是急性OTA暴露可以引起肝脏、胃肠道等器官和组织的细胞毒性[1]。同时有研究表明OTA与巴尔干肾病有关[2]。国际癌症研究机构(IARC)将OTA定位2B类致癌物[3]。本文就有关OTA的污染情况、限量、检测标准、分析方法和防控脱毒研究进展做一综述。

2 理化性质

OTA相对分子质量为403.8。由氯化的异香豆素类似物和苯丙氨酸以酰胺键连接而成，是一种白色、无味、热稳定的固体结晶物，水溶性差，可溶于NaHCO3溶液，易溶于醇、酮和氯仿等有机溶剂[4]，其熔点168～173 ℃。将OTA的乙醇溶液储于冰箱中一年以上也无损失，但应注意避光保存，如接触紫外线几天就会分解。在紫外线照射下呈绿色荧光，在苯-冰HAc(体积比99∶1)溶剂中的最大吸收峰为333 nm[4]。OTA的化学结构式见图1。

图1 赭曲霉毒素A的化学结构式Fig.1 Chemical structure of ochratoxin A

3 污染情况、限量和检测标准

3.1 污染情况

表1收集了最近10年我国各地区农作物(或以农作物为原料)中OTA的污染情况[5 - 20]。除农作物外，中药也常被OTA污染。甘草是中药中最常见的一味药，也是全世界范围使用最为广泛的一种中药。ArioA等[21]检测30批甘草样品，检出OTA污染率高达100%。Thirumala-Devi等[22]检测25批生姜、25批姜黄和50批胡荽样品。其中，2批生姜检出OTA，9批姜黄、20批胡荽受到污染，污染率分别为8%、36%和40%。人参是我国的传统中药，历来被视为百草之王，Trucksess等[23]检测了10批人参样品，OTA检出率为40%，阳性样品中OTA浓度范围为0.4～1.8 μg/kg。

表1 我国近10年各地区农作物(或以农作物为原料)中OTA的污染情况Table 1 OTA pollution in crops(or crops as raw materials) in recent 10 years in China

曲霉属产生OTA的条件是中温、寒冷气候；青霉属产生OTA的地区主要是亚热带[4]。Nguyen等[24]检测了美国144份早餐和零食(原料主要为玉米和燕麦)样品，污染率为52.08%，受污染早餐中OTA浓度为0.01～7.43 ng/g。Moez等[25]检测一批咖啡，OTA检出率高达97.7%。Elaridi等[26]检测了从摩洛哥五个不同城市的零售面包店购买的100份商业面包样品，阳性率为48%，并且有26份样品超过了当地的限量标准。Kumar等[27]收集了印度北部不同地区的50份小麦样品，有29份(58%)小麦样品中含有1.36～21.17 μg/kg的OTA，其中13份(26%)超过欧盟建议的5 μg/kg限量。

3.2 限量和检测标准

近年来，随着对OTA研究的深入，越来越多的国家(地区)和国际组织制定了食品和饲料中OTA的限量。表2总结了中国、国际食品法典委员会(CAC)、欧盟和日本、韩国、中国台湾和加拿大对OTA限量的最新标准。对于OTA的检测标准，CAC和欧盟指令规定，只要经过方法学验证的方法均可以用于执法目的，并且规定了方法必须满足的最低性能指标[28]。

表2 国内外对食品和饲料中OTA的限量Table 2 Limits of OTA in food and feed at home and abroad

表3为我国及我国部分地区OTA检测推荐的方法，表4为一些国际机构采纳和认可的OTA分析方法。

表3 我国推荐的OTA分析方法Table 3 OTA analysis methods recommended by China

表4 国际机构采纳、认可或规范的OTA分析方法Table 4 OTA analysis methods adopted,recognized or regulated by international organizations

国内外对食品中OTA的污染较为重视，建立的标准体系比较完善，对易感染OTA的各种食品也都有明确的限量规定。但对中药中OTA的污染情况及限量制订重视度还不够。目前，仅欧洲规定了极少数药食同源的中药(肉豆蔻、干姜、姜黄)和甘草中OTA的限量。真菌毒素的的污染是影响中药品质的主要因素之一，我国是中药的发源国，同时又是种植和出口大国，先行制订中药中OTA的限定及检测标准为其他地区提供参考是必然趋势。我国即将出版的《中国药典》(2020年版)规定了使用液相色谱法和液相色谱-串联质谱法测定中药材、饮片及中药制剂中的OTA。虽然并未规定易感染OTA中药的限量，但是弥补了中药中对OTA检测的空白。

4 分析技术

4.1 前处理

4.1.1 提取OTA为稳定的无色晶体化合物，易溶于极性有机溶剂和碳酸氢钠溶液，微溶于水[4]。目前OTA的提取方法主要有振摇提取、高速均质提取、超声提取和加速溶剂萃取[29]等方法。常用溶剂主要为甲醇、乙腈、磷酸盐缓冲溶液等。郑润生等[30]使用84%乙腈浸泡10种中药材和3种食品样品20 min后，涡旋振摇10 min提取，离心，取上清液用甲醇复溶(稀释4倍)，未经过净化直接上样检测10种中药材和3种食品中OTA污染情况，回收率为84.2%～100.0%。刘海波等[31]比较0.1 moL/L正磷酸∶甲醇∶水(1∶10∶4)、0.1 moL/L正磷酸∶甲醇(1∶10)、甲醇∶水(4∶1)、2%NaHCO3∶1%NaCl(1∶1)4种不同的溶剂对宁夏枸杞中OTA的提取效率，发现4种方法中0.1 moL/L正磷酸∶甲醇(1∶10)提取最为可靠。郑荣等[32]比较了不同的溶剂、时间和方法对薏苡仁等9种中药中OTA的提取效果，最终确定80%甲醇匀浆2 min 为最佳提取方法。Rupesh等[33]评估了可可豆中提取OTA的4种方法，最终确定了使用1%的NaHCO3溶液振摇提取，使用免疫亲和柱净化，加标回收率为86.5%。傅武胜等[34]使用多种方法联合提取药食两用类食品中OTA，样品中加入1 g NaCl和80%甲醇20 mL，涡旋5 s，超声30 min，再以300 r/min的速度振荡30 min，平均回收率在81．8%～107%之间。

4.1.2 净化OTA的净化目前主要有液-液萃取、固相萃取、免疫亲和柱净化法和基质固相分散技术等。陈东等[35]使用5%氨水调至pH=9.0，MAX固相萃取小柱富集的方法对葡萄酒进行前处理。方法的平均回收率为88.6%～108.0%，相对标准偏差为2.1%～9.2%。Karami-Osboo等[36]对葡萄干中OTA进行检测，比较了液-液萃取和免疫亲和柱净化两种方法，发现两种方法都有良好的效果，最终选择液-液萃取法对葡萄干中OTA净化。QuEChERs方法是近年来发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。Fernandes等[37]使用改良的QuEChERs方法提取净化葡萄酒中的OTA，用乙腈和无水MgSO4∶NaCl∶二水合柠檬酸三钠∶柠檬酸氢二钠(4∶1∶1∶0.5)对样品进行提取和分离。然后，使用分散固相萃取技术进一步提取和除杂。方法回收率为87.2%～102.6%，相对标准偏差均小于9%。

OTA的污染大多处于ppb级甚至更低的水平，且大多数基质复杂，干扰因素多，不利于检测。样品前处理的优劣很大程度影响检测结果的准确性。提取和净化是前处理的两个重要步骤，根据不同的基质选择合适的提取净化方法是保证检测结果的准确性的必要前提。

4.2 检测

4.2.1 薄层色谱薄层色谱法(TLC)是经典的分离方法，目前仍然是很多发展中国家的常规检测方法。但该方法操作复杂、重现性和灵敏度低，已逐渐被高效液相色谱法替代。Santos等[38]使用TLC对生咖啡中OTA进行定性和定量，结合IAC净化步骤，方法的检测限为0.5 mg/kg，具有较高的灵敏度和分辨率。

4.2.2 液相色谱及液-质联用技术高效液相色谱法(HPLC)及液-质联用技术灵敏度高,重现性好,溶剂用量少,能够准确的对OTA进行定量分析。HPLC是国际化学家联合会(AOAC)推荐检测咖啡、大麦和葡萄酒中OTA的方法。刘文红等[39]采用HPLC检测葡萄酒中OTA含量，OTA的回收率提高到88.6%～96.0%，相对标准偏差为0.59%～0.74%。Zhu等[40]采用HPLC测定40种浓香型白酒，30种淡香型白酒和6种酱油香型原液。加标样品的回收率在81.6%～100.8%之间，检测限和定量限分别为0.006、0.02 μg/L。Wu等[41]在中国东北地区随机收集了110种商业食品样品，包括面包、燕麦、大麦、玉米、玉米、小麦、葡萄、可溶性咖啡、大豆、红酒和婴儿食品。采用HPLC-荧光检测(FD)分析，并且使用液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)联用技术进行确认,OTA的平均回收率范围为78.3～103.3%，相对标准偏差为2.1%～4.3%。Campone等[42]通过优化主要参数，开发了自动在线SPE-HPLC-MS/MS方法，能够灵敏、可靠地定量葡萄酒样品中的OTA，该方法在不到20 min内完成对OTA的准确测定，可作为传统IAC方法的有效替代方法。

真菌毒素污染大多是交叉污染，一种毒素可以污染多种食物，一种食物常常被多种毒素污染。液相色谱法及液-质联用技术检测多种毒素应用较为广泛，相对于其他方法节省时间，方便快捷。Zhang等[43]利用LC-MS/MS技术同时测量29地龙批中多种真菌毒素，检测限为0.05～1 000 μg/kg。黄晓静[44]建立了75种真菌毒素的快速、灵敏、高通量的超高效液相色谱-四极杆飞行时间-质谱(UHPLC-Q-TOF MS)初筛方法，并成功将其运用在了30批甘草、30批白花蛇舌草及20批瓜蒌皮样品的多真菌毒素初筛中，并对低分辨质谱中的某些样品的阳性检出进行确证。

随着色谱技术的发展，液相色谱及其联用技术在OTA的检测中运用越来越广泛。尤其是液相色谱-质谱联用技术不仅可以对其他检测方法进行结果验证，并且灵敏度更高。随着该技术的逐渐普及，将会成为未来检测技术的趋势和首选方法。

4.2.3 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强的特点，适宜大批样品同时检测。利用酶标记的OTA与样品中的OTA竞争性与抗体进行键合反应，利用分光光度法测定，样品中OTA的浓度与吸光度成反比关系[4]。Pei等[45]采用ELISA法测定水稻、玉米、小麦和白葡萄酒样品中OTA，并与超高效液相色谱-荧光检测法(UPLC-FLD)对比，证明该方法有良好的重现性且可靠性高。Sun等[46]建立了ELISA法筛选谷物中OTA。发现该方法具有快速、一次检测时间不超过20 min、样品提取和净化过程简单、快速、成本低、无需仪器即可对检测结果进行直观评价等优点，适用于食品的常规定性分析。ELISA法可作为谷物样品OTA现场快速筛选的有效工具。ELISA特异性强、分析时间短、前处理简单，适合现场快速筛查。

4.2.4 基于核酸适配体的检测方法核酸适配体可与靶分子高亲和力、高特异性结合。目前主要有荧光适配体传感器、比色适配体传感器和化学发光适配体传感器。Lv等[47]利用核酸适配体对1%红酒缓冲溶液中添加一系列OTA浓度的测定，验证了其可行性，荧光强度与OTA浓度的对数呈良好的线性关系。刘继红等[48]通过体外指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选，获得了OTA的特异性核酸适配体，亲和力较高,特异性好,与OTA结构相似性化合物如赭曲霉毒素B、N-乙酰苯丙氨酸或华法林不结合或结合力非常弱。吕蕾等[49]以OTA适配体作为识别分子荧光素发射的荧光作为检测信号、纳米金作为荧光猝灭剂，利用荧光法检测OTA的含量，检测限达到10 nmol/mL。Wang等[50]建立了OTA的检测方法。互补DNA共轭氮掺杂石墨烯量子点(NGQDs-cDNA)作为荧光探针，功能化磁性纳米材料Fe3O4-适配体作为猝灭剂和分离介质，同时利用磁分离技术，去除了未结合适配体。方法检出限为0.66 nmol/L，可用于快速测定小麦和玉米中OTA残留。

5 防控和脱毒

5.1 防控

目前，对OTA的防控手段主要为物理、化学和生物防控。物理防控是利用辐射、热、光等物理手段抑制毒素生长和合成。Oueslati等[51]研究了三种交替温度循环(20/30 ℃、20/37 ℃和25/42 ℃)和光周期对OTA产生的影响，结果表明不同温度条件对菌丝生长和OTA产量均有显著影响。化学防控是利用化学试剂杀灭真菌，但由于化学试剂大多为有毒有害物质，所以应用较少。目前，有研究人员发现植物精油可以干扰OTA的合成[52]，有较好的应用前景。生物防控是利用不产毒真菌对抗产毒真菌，降低产毒真菌种群密度的从而减少OTA的污染。赵琳等[53]对27种植物乳杆菌对液体培养基内OTA的清除能力、清除途径、影响因素进行研究。发现有些植物乳杆菌能够有效地吸附培养基中OTA。Cebrián等[54]利用不产毒真菌和酵母共同对抗火腿中产生OTA的青霉，显著降低了火腿中OTA的含量。彭青枝等[55]研究了紫外照射处理、温度处理和杀菌剂处理(抑霉唑、多菌灵和咪鲜胺)对果蔬采后OTA产生量的影响。实验结果表明：OTA产生量随着紫外照射时间延长呈先增加后减少；4 ℃下可以完全抑制生长和OTA的产生，25 ℃时其生长量和毒素产生量最多；多菌灵0.12 μg/mL，抑霉唑和咪鲜胺0.06 μg/mL会刺激炭黑曲霉产生大量的OTA。

5.2 脱毒

对于已被污染的食物可采用脱毒的方法来减少OTA的污染。迟蕾等[56]比较不同剂量γ射线辐照处理的OTA的降解率。结果表明，玉米中OTA经过辐照后含量明显降低，在10 kGy的辐照剂量下，降解率可达50%。罗小虎等[57]使用臭氧和电束辐照降解OTA，比较了不同浓度的臭氧和不同处理时间、不同辐照剂量的电子束辐照对OTA的降解率，实验结果表明50 mg/L的臭氧处理30 s，以及12 kGy剂量电子束辐照对OTA的降解效果最佳。熊科等[58]将黑曲霉M00988菌株中具有降解OTA能力的关键羧肽酶cp基因进行克隆，并原核重组表达该酶。解决了天然酶酶量低且不易纯化的缺点，为羧肽酶降解OTA在工业上的固定化应用奠定了基础。Calado等[59]测定γ射线对不同基质中OTA降解的情况，发现OTA对水溶液中的辐射非常敏感，但对其干燥形式和食品基质具有抗性。为后续研究OTA降解提供了依据。

6 结语

OTA具有高毒性，在食品及中药中污染范围广，各国已陆续规定了食品和饲料中OTA的限量和检测标准，但对中药中OTA的限量和检测规定不够完善。为保证安全地使用中药，建议可参照食品中限量和检测标准，制订相关法定标准。随着研究的深入，对OTA的检测方法也越来越多，由早期的薄层色谱法到现在的液相色谱、免疫测定等方法发展都较为迅速，在对OTA检测时，应根据不同的需求和目的选择合适的方法。OTA的防控和脱毒一直是热点，同时也是难点。其中防控主要以化学方法为主，但由于化学试剂有毒、污染环境、破坏生态，其使用一直受到限制。生物防控的研究为OTA的防控提供了新思路，其具有环保、无残留、效果好等优点，具有较好的发展前景。