高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定富硒碎米荠中的硒形态

林 樾， 陈尚卫， 虞锐鹏， 于 添， 丛 欣， 朱 松*

(1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.恩施德源健康科技发展有限公司，湖北恩施 445000)

硒是具有抗氧化防御功能，维持机体内氧化还原平衡的重要微量元素[1,2]。但是如所有必需微量元素一样，硒不能由人体自主合成，只能由外界摄入来维持其在人体内的正常水平。硒在自然界主要以无机硒和有机硒的形态存在[3]，硒对人体的影响不仅与摄入量有关，更与其化学形态有很大关系[4]。在人体对硒的利用方面，有机硒比无机硒毒性小，有更高的生物利用度，更易于被吸收[5]。我国有72%的地区不同程度缺硒[6]，因此，开发天然的有机硒膳食补充剂至关重要。植物可以有效地将无机硒通过自身代谢作用转化为不同形态有机硒，因此被认为是天然有机硒合成的生化工厂[7]。植物中的有机硒主要以硒代氨基酸或其衍生物的形态结合于蛋白质[8,9]。人们通过饮食摄入的硒很大一部分来自于富硒植物[10]，有几百年食用历史的十字花科植物碎米荠，由于其对硒吸收的良好耐受性，能获得较高的硒生物积累[11]，有作为有机硒补充剂的巨大潜力。

对于植物样品中硒形态的分析，如何将样品中不同形态硒充分地、无转化地有效提取是解析植物中硒形态准确性的关键。水或弱酸直接提取只适用于游离含硒化合物的提取[12]，而对于结合在蛋白上的有机硒，酶解法不但能够有效地将其释放，而且温和的提取条件可以更小程度地减少硒形态之间的转化。酶解法虽然效率较高，但有机硒的回收率差异较大，这取决于有机硒与蛋白的结合方式及结合位点，使得蛋白酶的选择和酶解条件的优化非常重要。

目前高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG -AFS)[13]，以及高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)[14]是硒形态分析的两种常用方法，其中HPLC-ICP-MS具有检出限低和稳定性好的优点，近年来的应用更为广泛。秦冲等[15]采用Hamilton PRP X-100色谱柱分离了小麦中的硒，但只分离出了Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、硒代半胱氨酸(SeCys2)和硒代蛋氨酸(SeMet)4种硒形态。Fontanella等[16]分离了经生物强化后的葡萄酒中5种硒形态，但时间长达20 min。Milovanovic等[17]分析了平菇中硒和硫的形态，在酶解处理过程中蛋白酶用量较多导致实验成本较高，不适用于推广应用。方勇等[18]应用Alltima C8色谱柱建立了大蒜中5种硒形态分离方法，但其中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)两种无机硒分离效果不佳。为了分析富硒植物碎米荠中硒形态分布，同时更好地探究其应用价值，本文通过研究酶解提取过程中酶种类、时间、辅助剂添加、酶解次数对硒提取效率的影响，优化条件下，采用HPLC-ICP-MS法对其中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、SeCys2、SeMet 5种硒形态进行分离分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪、电感耦合等离子体质谱仪(美国，珀金埃尔默仪器有限公司)；微波消解仪(美国，CEM公司)；金属浴磁力搅拌器(德国，IKA公司)；分析天平(梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)。

Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys标准溶液(中国计量科学研究院)；SeCys2、SeMet标准溶液(北京百灵威科技有限公司)。七氟丁酸(HFBA，阿拉丁试剂有限公司)；KH2PO4、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲醇(色谱纯)(国药集团化学试剂有限公司)；碎米荠干粉、复合蛋白酶(湖北省恩施德源健康科技发展有限公司)；蛋白酶E(上海颖心实验室设备有限公司)；中性蛋白酶(杰能科生物工程有限公司)；风味蛋白酶(诺维信生物技术有限公司)；蛋白酶K(默克生命科学技术有限公司)。其它所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 总硒的测定取碎米荠样品0.1 g(精确到0.0001 g)于消解罐中，加入4 mL HNO3过夜后，加入5 mL超纯水，于微波加速反应平台中消解。微波消解结束后，用超纯水将消解液定容稀释到合适体积，摇匀待测。每个样品做三次平行，同时做空白实验。

1.2.2 硒形态的测定取碎米荠样品0.1 g(精确到0.0001 g)，在温度40 ℃的条件下，加1 mg SDS，溶于7 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.5)中，先加10 mg风味蛋白酶搅拌4 h，后加10 mg蛋白酶E搅拌4 h。于4 000 r/min离心15 min后取上清液，得到上清液1。沉淀物依照以上的酶解条件再次酶解离心后取上清液，得到上清液2。合并上清液1和2，定容到合适体积，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，使用HPLC-ICP-MS法测定各硒形态含量。实验流程图见图1。

图1 样品酶解实验流程Fig.1 Experimental process of sample enzymolysis

1.2.3 仪器条件色谱条件：采用Thermo Scientific Hypersil GOLD C8色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，赛默飞世尔科技有限公司);以含0.05%七氟丁酸与3%甲醇的20 mmol/L KH2PO4为流动相，等度洗脱;流速:1.2 mL/min;数据采集时间:7 min;进样量:15 μL。ICP-MS条件：射频功率：1 100 W;雾化室气流:0.91 L/min;辅助气流速:1.2 L/min;泵速:0.8 r/s;测定模式：动能歧视模式(KED);定量同位素：78Se。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

目前硒形态分析常用的色谱柱是离子交换柱，其中以Hamilton PRP X-100色谱柱居多，但在进行实际样品的测定时，由于植物样品在酶法提取时会有较多的酶残留在提取液中，这些大分子物质会对色谱柱造成一定的损害，导致色谱柱的使用寿命缩短，而C8色谱柱更适合分析大分子类的物质，具有更长的使用寿命。因此本实验中选择C8色谱柱进行硒形态的分离。实验以含3%甲醇的20 mmol/L KH2PO4作为流动相，发现只能分离出Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2，而MeSeCys、SeMet在20 min内均没有出峰。在流动相中加入七氟丁酸(HFBA)作为离子对试剂，发现不同浓度的七氟丁酸对5种硒的出峰时间也有一定的影响，如图1所示。当流动相中加入0.1%的七氟丁酸时，5种硒形态均能得到较好的分离，但SeMet出峰时间达到14 min左右。为缩短分离时间，尝试降低七氟丁酸浓度，当浓度降低为0.05%时，在6 min内可完成5种硒化合物混合标样的测定，色谱图如图3所示。

图2 不同浓度HFBA时5种硒形态的出峰时间Fig.2 Peak time of five speciations of selenium under HFBA with different concentrations

图3 5种硒化合物混合标样的色谱图(浓度100 μg Se/L)Fig.3 Chromatogram of a mixture of five selenium standards(100 μgSe/L)

2.2 硒形态提取条件优化

2.2.1 蛋白酶的选择酶法提取是植物硒蛋白中有机硒的有效提取方法。Ni等[19]采用胃蛋白酶处理富硒竹笋，测定其中的有机硒形态及含量。Gergely等[20]在检测蘑菇中的硒形态时尝试采用不同蛋白酶联合水解提取，发现胰酶和蛋白酶ⅩⅣ的组合提取效率最高。不同蛋白酶的提取效果也不尽相同，因此我们考察了不同蛋白酶(复合蛋白酶、蛋白酶E、蛋白酶K、中性蛋白酶、风味蛋白酶)和酶解时间对硒提取效率的影响，结果如图4。研究表明蛋白酶E的提取效率最高，蛋白酶K的提取效率次高，其余三种酶的提取效率一般。蛋白酶E和蛋白酶K对硒的提取效率好但两种酶的价格都比较高，而风味蛋白酶的价格较为低廉并且对硒代蛋氨酸的提取有一定的促进作用。另外在8 h时几种酶的提取效率都有明显的提高，随后的时间段变化比较平稳。随着时间超过12 h硒形态有不稳定的情况出现，推测可能是由于硒形态发生转化导致。基于以上的考虑，我们选择蛋白酶E和风味蛋白酶作为后续实验用酶，酶解时间为8 h。

图4 不同蛋白酶和酶解时间对硒提取效率的影响Fig.4 The effect of protease types and enzymolysis time on the extraction efficiency of selenium

2.2.2 加酶方式对硒提取率的影响考察了风味蛋白酶，蛋白酶E以及两种酶复合提取对碎米荠中硒提取率的影响。复合酶提取采用三种方式：方法(1)：先加10 mg蛋白酶E搅拌4 h后，再加10 mg风味蛋白酶搅拌4 h；方法(2)：先加入10 mg风味蛋白酶搅拌4 h后，再加入10 mg蛋白酶E搅拌4 h；方法(3)：同时加入10 mg蛋白酶E，10 mg风味蛋白酶搅拌8 h。结果如图5，发现复合酶比单酶有更好的提取效率。其中，先加风味蛋白酶后，再加蛋白酶E的方法提取效率最高，可能由于随着时间的增加，酶的活性有所下降，及时添加酶保证了体系中酶的浓度。同时我们发现两种酶的加入先后顺序不同也会对提取效率造成影响。在酶解过程中溶液体系的pH值不断下降，蛋白酶E的最适pH值在7.5左右，而风味蛋白酶的最适pH值范围在6～8之间，先加风味蛋白酶后加蛋白酶E的顺序，使两种酶恰好能在较合适的pH值条件下进行反应，从而达到了更好的酶解提取效果。

图5 加酶方式对硒提取效率的影响Fig.5 The effect of the way of adding enzyme on the extraction efficiency of selenium

2.2.3 辅助酶解剂添加对硒提取率的影响SDS可以使蛋白质变性，形成离子对溶解不溶性蛋白质，从而能够更彻底地水解蛋白质，将结合态的有机硒从蛋白质中酶解分离出来，达到更高的有机硒提取效率[21]。加入SDS辅助后对提取效率有一定的促进作用，可使碎米荠中硒提取率上升10%左右。

2.2.4 酶解次数对硒提取率的影响第一次酶解后硒提取率只达到了60%左右，延长时间又会导致硒形态的转化。实验采取多次酶解法，将第一次酶解后的残渣用同样的方法再一次酶解来提取其中残余的硒，第二次酶解后提取率明显升高，而在第三次酶解时硒的提取率变化较小。为了节约提取时间，最终采用两次酶解法来提取碎米荠中不同形态的硒。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线与检出限配制0.5、1.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μgSe/L的硒标准混合溶液，在优化后的实验条件下进行分析，以硒的浓度(x)为横坐标，色谱峰的面积(y)为纵坐标，结果表明5种形态硒线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)计算该方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，5种形态硒的LOD在0.08～0.25 μgSe/L之间，LOQ在0.25～0.54 μgSe/L之间。5种形态硒的回归方程、线性范围及LOD和LOQ见表1。

表1 5种形态硒的线性关系及检出限Table 1 Linear relationship and limits of detection for five speciations of selenium

2.3.2 准确度和精密度称取6份富硒碎米荠样品，采用文中酶法提取方法处理后，按优化色谱条件分析，计算精密度(RSD)。由表2可知，RSD小于5%，说明该方法精密度良好，能满足样品检测要求。将样品酶法提取预处理后每隔2 h进行测试，其RSD小于5%，说明样品在10 h内稳定性良好。重复制备样品6次进行测试，RSD小于5%，说明该方法重复性良好。

为验证方法的精密度，选取一种碎米荠样品，分别添加100、300、500 μgSe/mL 3个浓度的硒混合标准溶液进行加标回收实验，每个浓度做3个平行。5种形态硒加标回收率在85.8%～106.3%范围，RSD小于3.58%，结果见表2。

表2 5种形态硒的回收率、精密度、稳定性实验结果Table 2 Repeatability,stability and recovery of five speciations of selenium

2.4 实际样品测定

运用本实验建立的方法，将4种碎米荠进行硒形态分析，结果如表3。发现不同碎米荠样品中硒形态分布也不完全相同，其中主要形态为以SeCys2和SeMet为主的有机硒，两种有机硒的含量高达52.23%～70.21%。酶法处理后硒的提取率为81.05%～89.21%。图6为4种碎米荠形态分析的液相色谱图。碎米荠样品中还有少量的未知形态硒的色谱峰，还有待于进一步通过质谱进行鉴定。

表3 碎米荠中硒形态分析结果(mg/kg)Table 3 Analysis results of selenium speciation in Cardamine violifolia(mg/kg)

图6 4种碎米荠硒形态分析的色谱图Fig.6 Chromatograms of selenium speciation for 4 kinds of Cardamine violifolia

3 结论

本研究通过酶法提取，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法分析富硒碎米荠中硒形态，并进行了方法学验证。该方法硒提取效率较高，成本较低，优化条件下可在6 min内完成5种不同形态硒的检测。采用该方法对碎米荠中硒形态分析，发现其中硒以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸等有机硒为主，同时含有少量无机硒和未知硒化合物，对于其中未知硒化合物，还有待于进一步通过质谱手段进行鉴定。