超高效液相色谱-串联质谱法测定畜禽毛发中4种违禁氟喹诺酮类兽药

费 丹， 王梦芝， 周瑶敏， 谢 敏， 胡丽芳， 郑小明，周日龙， 闵佳玲， 余云云， 徐 俊*

(1.江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西省农产品质量安全重点实验室，江西南昌 330200；2.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；3.江西省玉山黑猪原种场，江西上饶 334700)

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQS)是在喹啉环的6位上加入了氟原子，7位上连有哌嗪基的一类衍生物[1,2]。在兽医临床上，常作为细菌感染类疾病的治疗药物，具有抗菌谱广、高效、低毒、促生长等优点[3,4]。然而，在动物养殖过程中经常出现超剂量、超范围使用，使得细菌产生耐药性[5]。与此同时，氟喹诺酮类药物残留造成的食品安全问题层出不穷，残留有药物的畜禽产品通过食物链传递可能对人体产生一系列危害，如造成中枢神经系统紊乱，使人出现失眠、头痛及惊厥等症状，严重的还会引发光毒性、肝肾毒性和溶血性贫血等疾病[6]。鉴于此，中国农业农村部于2015年发布了2292号公告，要求停止在食品动物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星这4种兽药。然而，近几年风险评估研究发现这4种违禁药物依然在养殖过程中违规使用，尤其是养殖户为了逃避农产品质量安全监管，常在养殖前端过程中使用，而畜禽在屠宰上市时由于药物自身代谢作用，常规的快检设备无法检出药物残留，这无形中给畜禽产品养殖全过程的质量安全监管带来了难题。

当前，氟喹诺酮类药物的分析检测手段主要包括分光光度法、放射免疫法(RIA)、微生物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、电解分析法、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)等[7 - 11]。其中，液相色谱-串联质谱法尤其对复杂样品具有较高的分离能力，并且选择性强、灵敏度高，能够提供相对分子量和结构信息，因此是目前兽药残留等痕量分析的主要方法[12,13]。由于氟喹诺酮类抗生素特殊的化学结构，容易生成正离子，因此流动相中常添加甲酸，以此来提高离子化效率。检测基质主要包括畜禽肌肉组织、鸡蛋、血浆、内脏或兽药等[14 - 16]。其中，肌肉、内脏、血液需要通过屠宰动物的方式来获取样品，其成本高、步骤繁琐。收集畜禽毛发样品不仅可以避免动物被屠宰，并且取样简便、易于保存；此外，毛发组织中没有血液循环和降解药物的活性物质以及高效的排泄方式，因此药物的代谢缓慢，并且在毛发中的残留时间比其他组织更长，有利于养殖过程中对违禁药物使用的高效监管[17]。

目前，已有关于人头发中农药[18]残留检测，以及畜禽毛发中利巴韦林[19]、氟虫腈[20]等药物残留检测的研究报道，而有关畜禽毛发中培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和诺美沙星4种违禁氟喹诺酮类药物的检测方法鲜有报道。本研究通过乙腈-乙酸混合提取，采用PSA/C18净化管进行基质分散净化，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱分离，电喷雾串联质谱多反应监测(MRM)模式测定，建立了畜禽毛发中上述4种违禁氟喹诺酮类兽药残留量的检测方法，为畜禽产品在养殖过程中的高效监管提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6495超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司)；MS205DU电子分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；GL-88B型旋涡混合器(海门市Qilinbeier公司)；KH-500DB型数控超声波清洗器(昆山HeChuang Ultrasonic公司)；电热恒温干燥箱(上海HeDe Laboratory公司)；离心机(上海SH-AnTing公司)；N-EVAP112氮吹仪(美国，Organomation公司)；0.22 μm尼龙滤膜(美国，Agilent公司)；Milli-Q超纯水器(Millipore公司)；固相萃取装置(美国，Supelco公司)。

培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星-D5、氧氟沙星-D3、诺氟沙星-D5、洛美沙星-D5(美国Sigma-Aldrich公司)；十八烷基硅烷(C18，粒径40～60 μm，上海阿拉丁公司)；色谱纯甲酸、甲醇、乙腈(美国Fisher试剂公司)；十二烷基硫酸钠(SDS，上海Macklin公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA，粒径40～60 μm，美国Welchrom公司)；HLB固相萃取柱(美国Waters公司)；其余试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的配制

标准储备溶液(1.0 mg/mL)：准确称取适量培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星及其相应的同位素内标物标准品，用甲醇分别配制成1.0 mg/mL的单标储备溶液，置于-20 ℃下避光储存。标准中间溶液(10.0 mg/L)：分别移取0.1 mL标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇分别稀释成质量浓度为10.0 mg/L的单标中间溶液，置于-20 ℃下避光储存。

混合标准中间溶液(1.0 mg/L)：取上述标准中间溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成质量浓度为1.0 mg/L的混合标准中间溶液，置于-20 ℃下避光储存；取上述同位素内标物的标准中间溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成质量浓度为1.0 mg/L的同位素内标物混合标准中间溶液，置于-20 ℃下避光储存。混合标准工作溶液(100.0 μg/L)：取上述混合标准中间溶液5 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释成质量浓度为100.0 μg/L的混合标准工作溶液，置于4 ℃下避光储存；取上述同位素内标物的混合标准中间溶液5 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释成质量浓度为100.0 μg/L的同位素内标物混合标准工作溶液，置于4 ℃ 下避光储存。

1.3 样品制备

实验所用牛毛采自当地肉牛养殖场，培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星检测结果均为阴性。

毛发的清洗：使用浓度1%SDS溶液浸泡毛发30 min，随后用水漂洗多次至漂洗液澄清，置于40 ℃恒温烘箱1 h后，取出晾干，剪碎成1～2 mm，存放于干燥器中，备用。

1.4 样品前处理

准确称取50 mg经上述处理后的毛发样品于15 mL离心管中，滴加浓度为100.0 μg/L的混合内标溶液20 μL和5 mL 1%乙酸-乙腈溶液。室温下超声反应30 min，于5 000 r/min离心5 min，取上层清液至事先已加入100 mg PSA和100 mg C18吸附剂的15 mL离心管中，涡旋30 s后于5 000 r/min离心5 min，将上清液转移到另一离心管中，在45 ℃条件下氮气吹至近干，加入1 mL流动相(0.1%甲酸水溶液)溶解，使用0.22 μm有机滤膜过滤后，待上机检测。

1.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)(Agilent)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序为：0～1 min，B保持10%；1～5 min，B由10%线性升至50%；5～6 min，B由50%线性降至10%；6～6.5 min，B保持10%。流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：35 ℃。

1.6 质谱条件

电离模式：电喷雾电离正离子(ESI+)模式；检测方式：多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：3 000 V；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：150 ℃；干燥气流量：15 L/min；雾化气压力：30 psi；鞘气温度：300 ℃；鞘气流量：11 L/min。

2 结果与讨论

2.1 超高效液相色谱-串联质谱分析结果

随着超高效液相色谱-串联质谱法在药物残留检测的广泛应用，使得分析检测更高效灵敏，尤其适合大批量样品的分析检测[21]。本研究采用超高效液相色谱，以0.1%甲酸水溶液-甲醇做流动相，分离4种违禁氟喹诺酮类兽药，通过质谱定性及定量检测。根据氟喹诺酮类化学结构特点，容易得到H+而形成[M+H]+准分子离子，故本研究选择正离子模式检测，建立畜禽毛发中4种氟喹诺酮类药物残留的定性定量检测方法。该方法分离效果较好，结果见图1。

图1 培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星及其内标物标准的定量离子色谱图Fig.1 Chromatograms of quantitative ion for pefloxacin,ofloxacin,norfloxacin,lomefloxacin and their internal standards

采用内标法对样品进行定量分析，在一定程度上可消除因为操作条件和检测仪器带来的误差，进一步提高检测结果的准确度，适用于畜禽毛发样品中培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星这4种违禁氟喹诺酮类兽药残留的痕量分析检测。检测参数见表1。

表1 目标化合物及其内标检测参数Table 1 Detection parameter of target compounds and the internal standard

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 提取方法优化畜禽毛发结构致密，药物通常残留于毛髓质中，外部有较厚的角质层包裹，因此需采用剪碎研磨的处理方式，使毛发的角质层破碎，毛髓质中药物呈游离态进入提取溶液，通过水解的处理方式破坏毛发的内部结构，使药物从中释放出来。依据畜禽毛发样品的吸附特性和氟喹诺酮类药物的溶解性，对毛发中培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星的提取溶剂进行了优化。分别在毛发样品中加入2%甲酸甲醇溶液、乙腈-50%HCl(1∶1,V/V)、乙腈-1%HAc溶液、乙腈-2%甲酸溶液、乙腈-磷酸盐溶液，并添加50 μL 1 mg/L混合标准品溶液，其余步骤按“1.4”处理，研究不同提取溶剂的加标回收率。结果如图2所示，经乙腈-1%HAc溶液超声提取后样品色谱峰杂质干扰最小，可以最大程度地去除毛发的基质成分，其回收率均高于其他4种提取溶剂，因而将乙腈-1%HAc溶液作为本实验的提取溶剂。

图2 不同提取溶剂的回收率Fig.2 Recovery of different extraction solvents

对比分析了不同水浴温度和超声振荡时间对培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星的提取效果，筛选出3组较优的方案进行进一步优化。制备了添加50 μL 1 mg/L混合标准品溶液的样品，用乙腈-1%HAc溶液提取后，分别经25 ℃水浴超声振荡2 h、65 ℃水浴超声振荡2 h、80 ℃水浴超声振荡1 h处理，然后在5 000 r/min下离心5 min，取200 μL上清液，再加入800 μL初始流动相(0.1%甲酸甲醇溶液)混匀，滤膜过滤后上机检测。3种不同水解条件下4种目标物的回收率如图3所示，水浴温度25 ℃和65 ℃的提取回收率高于80 ℃提取条件，可见升高水浴温度后目标化合物的提取效果不佳。考虑实验操作条件的简便和节能因素，最终选择25 ℃条件下水浴超声振荡2 h。

图3 不同水解方法的回收率Fig.3 Recovery of different hydrolysis methods

2.2.2 净化方法优化水解反应后的毛发产物一般要进行提取及净化处理，以此来降低干扰物对检测的影响，并达到浓缩分析物的目的。通常采用液-液提取(LLE)和固相萃取(SPE)的方式完成提取和净化步骤。其中，SPE多数使用NH2、SCX、C18、GCB及混合模式(C18+SCX)等[22,23]。本方法选择PSA/C18净化管和HLB固相萃取柱分别对毛发提取液进行净化，对比两种方法的加标回收率。结果显示，经PSA/C18净化管处理的样品回收率和净化效果较好，因此选用PSA/C18净化管进行毛发提取液净化。

2.3 基质效应

本文选择经样品前处理后的空白基质和纯溶剂分别稀释标准品，配制标准曲线，用二者的斜率计算基质效应，即：(空白基质液标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率-1)×100%，该值为负数表示基质对化合物的响应有抑制作用，该值为正数表示基质对化合物的响应有增强作用，其绝对值越大抑制或增强的作用越强。实验结果表明，基质效应对4种化合物均为抑制作用，但影响不大，具体见表2。

2.4 线性范围、检出限和定量限

采用空白基质溶液配制质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的系列标准溶液，其中同位素内标浓度为2 μg/L，标准曲线方程及相关系数结果见表2。4种目标化合物在0.2～20 μg/L范围内成线性相关，相关系数r2均大于0.993，线性良好，将标准溶液稀释至信噪比(S/N)为3和10时的浓度分别定为目标化合物的检测限和定量限，结果得出氧氟沙星和诺氟沙星的检测限为0.05 μg/kg，定量限为0.1 μg/kg；洛美沙星和培氟沙星的检测限为0.08 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg(表2)。

2.5 回收率和精密度

参照方法定量限，在阴性样品中添加了由低到高3个浓度水平的标准品混合溶液，每个浓度做6组平行实验，分别计算加标回收率及其相对标准偏差(RSD)，结果见表2。本方法回收率在87.09%～114.95%范围内，RSD在0.13%～4.92%之间。Xiang等[24]采用超高效液相色谱-串联质谱检测鸡毛中的诺氟沙星残留，方法检出限为0.3 g/kg，定量限为1.0 g/kg，回收率为89.2%～95.7%，RSD均小于10%。本实验结果与其结果相似，方法满足畜禽毛发中氟喹诺酮类药物的分析检测。

表2 标准曲线，基质效应，回收率，检出限(LOD)和定量限(LOQ)Table 2 Standard curve equation,matrix effect,recovery,LOD and LOQ

2.6 实际样品检测

应用所建立的方法，在农贸市场共采集9份麻鸡毛发样品和3份肉牛毛发样品进行检测。检出2份麻鸡毛发中残留氧氟沙星，其残留水平为0.2651 μg/kg和0.2768 μg/kg。2份麻鸡毛发阳性样品检测色谱图见图4，检出氧氟沙星的阳性样品色谱峰形良好。

图4 实际样品色谱图Fig.4 Chromatogram of actual sample

3份肉牛毛发样品均未发现存在培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星残留。说明毛发可作为畜禽使用氟喹诺酮类药物的检测基质，适用于畜禽养殖的全过程监管。由此可见，上述所建立的方法具有很强的实际应用价值。

3 结论

利用超高效液相色谱-串联质谱联用技术，建立了一种利用畜禽毛发检测培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星4种违禁氟喹诺酮类兽药的分析方法。该方法前处理简单，检测限及定量限较低，有效地提供了一种借助畜禽毛发来监管养殖过程中违禁药物培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星等违规使用的新思路，为畜禽产品质量安全监管提供了新的技术手段。