沉默FOXC1对宫颈癌HeLa细胞侵袭和转移能力的影响

张婕 汪露 韩世愈

宫颈癌(cervical cancer，CESC)属于女性生殖系统恶性肿瘤，发病率及死亡率较高，对女性生命和健康存在极大威胁。据统计，全球每年新发病例约53万人，死亡人数高达27万人[1]。临床统计资料显示，80%以上有夫妻生活经历的女性存在程度不等的宫颈疾病困扰，而处于17岁～28岁阶段的女性更易患宫颈疾病，一些女性未及30岁即发生了早期宫颈病变，有的甚至出现晚期宫颈病变，在发病年龄方面相较于以往提早了近十年[2]。在恶性肿瘤的迁移与侵袭活动中，上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)发挥着关键性影响。肿瘤的形成与发展过程涉及诸多基因以及步骤，其中EMT对于源于上皮的恶性肿瘤迁移与侵袭行为发挥着关键性影响[3]。EMT，即在一定生理与病理环境中上皮细胞转分化为间充质细胞的行为。此行为发生期间，上皮细胞的细胞极性、细胞间的黏附性逐渐丧失，游走性能与侵入能力显著提升[4]。叉头框C1蛋白 (forkhead box protein C1， FOXC1)是一种新型转录因子，研究显示，FOXC1在恶性肿瘤发病、进展过程中发挥着重要作用，例如，在鼻咽癌中检测到FOXC1的高表达，而FOXC1通过上调波形蛋白、纤维连接蛋白和N-cadherin的表达[5]，在EMT中起到关键作用。FOXC1在乳腺癌中是EGFR功能的关键调节因子，目前已发现FOXC1的显著上调可通过激活Hedgehog信号通路来调控癌症干细胞特性的丰富[6]。在肝细胞癌中，FOXC1通过调节EMT参与微血管浸润[7]。有报道表明，FOXC1的异常表达与多种癌症的发生和发展有关，包括乳腺癌、肝细胞癌、胰腺癌和非小细胞肺癌[8-11]。然而，FOXC1的表达及其在宫颈癌中的潜在作用尚不清楚。本研究旨在探讨沉默FOXC1的宫颈癌细胞的侵袭及转移能力的影响情况，现将结果报告如下。

材料及方法

一、材料

正常宫颈细胞NC104与人宫颈癌 CaSki、ME-180、HeLa细胞购于中科院上海肿瘤研究所，细胞均用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。引物设计后由上海生工合成，LipofectamineTM转染试剂购于汉恒生物，pLKO.1-shFOXC1(本实验室克隆)。β-catenin抗体、Vimentin抗体、E-cadherin抗体购于美国Affinty 公司，TRANSWELL小室及Matrigel基质胶购于corning公司。DMEM培养基和小牛血清购自Gibco公司。

二、四种细胞中FOXC1mRNA及蛋白水平表达

1.细胞总RNA用TRIzol试剂盒提取：RT-PCR 95℃ 30 s，95℃ 5 s 40个循环，60℃ 30 s。引物序列如下。

FOXC1:

5′-CTG CCC GAC TAC TCT CTG C-3′

5′-CAC CGA GTG GAA GTT CTG C-3′;

GAPDH:

5′-CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA-3′

5′-TTC ACA CCC ATG ACG AAC AT-3′。

采用2-ΔΔCT法计算FOXC1 mRNA相对表达量。

2.Western Blot检测四种宫颈癌细胞中FOXC1基因的表达：FOXC1蛋白表达采用Western blot法。收集四组细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解充分约30 min，提取总蛋白，进行蛋白定量检测并制备蛋白样品。SDS-PAGE电泳，湿转法转膜，5% BSA摇床室温封闭1 h，1×TBST洗涤3次，每次15 min。加入FOXC1(1∶1 000)和内参GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，每次15 min;加入二抗(1∶2 000)室温杂交1 h，1×TBST洗涤3次，每次15 min；ECL显影、曝光。实验均重复3次以上，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值计算FOXC1蛋白相对表达量。根据RT-PCR及Western blot检测宫颈癌HeLa细胞中FOXC1表达量较高。

三、基因转染

取对数生长期的HeLa细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为4×105/mL，6孔板中每孔2 mL细胞悬液接种，常规培养。待细胞状态良好且融合度达60%～80%时，更换为无血清培养基。实验分为3组。 (1)对照组:转染阴性的Hela细胞; (2)阴性对照组:用pc DNA3.1 (+) -neo质粒转染Hela细胞; (3) 转染特异性siRNA组:用pLKO.1-shFOXC1转染Hela细胞。转染方法参照Lipofectamine2000转染方法进行操作。转染48 h后进行培养， 3 d后嘌呤霉素筛选阳性细胞连代培养，通过倒置显微镜观察转染效率，RT-PCR及Western Blot检测转染后细胞中FOXC1mRNA及蛋白表达，达到稳定转染后进行后续实验。

四、Transwell小室迁移及侵袭实验

1.检测转染后细胞迁移能力：制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×105/mL。取细胞悬液200 μL加入Transwell上室， 下室中加入500 μL的DMEM培养液，小心消除基质胶与培养液间的气泡。48 h后进行取样，吸净chamber上室内液体，无菌镊子取出chamber，移至800 μL甲醇溶液内，室温固定30 min。从甲醇溶液中取出chamber，吸干甲醇溶液，移至800 μL Giemsa染色液中，室温染色30 min，后用去离子水冲洗后吸干液体，湿棉棒擦去chamber上室未迁移细胞，PBS冲洗3遍。倒置显微镜下随机取9视野，并记数。

2.检测转染后细胞侵袭能力：用Matrigel基质胶包被Transwell小室基底膜，Matrigel胶4℃过夜融化备用，用4℃预冷的无血清DMEM培养基1∶3稀释Matrigel至终浓度为1 mg/mL，冰上操作;灭菌枪头包被小室的底部,37℃静置1 h，使其干成胶状。其余方法同迁移实验，并记数。

五、检测细胞转染后β-catenin、Vimentin及E-cadherin蛋白表达

收集三组转染48 h的细胞，实验分组包括空白对照组(HeLa)、空载组(GFP- HeLa)、HeLa-FOXC1(-)组，分别提取细胞总蛋白，Western blot检测 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达差异，参照二-2中采用Western blot法检测β-catenin、Vimentin及E-cadherin蛋白相对表达量。

六、统计学处理：采用SPPS 17.0软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验，计量资料用表示，采用单因素方差分析及两两比较的q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、四种细胞中FOXC1 mRNA及蛋白表达

应用PCR及Western Blot方法检测正常宫颈细胞NC104及宫颈癌 CaSki、ME-180、HeLa细胞株中FOXC1表达。PCR及Western Blot结果提示宫颈癌HeLa细胞中FOXC1高表达。

二、慢病毒转染及筛选稳定转染FOXC1细胞

1.以MOI=30 慢病毒感染HeLa细胞系，48 h后荧光显微镜观察GFP荧光蛋白的表达情况见图2。并以嘌呤霉素筛选出稳定表达FOXC1 shRNA的细胞，流式细胞仪分选计数，其平均荧光细胞比率为(93.71±0.26)%。

图1 RT-PCR检测四组细胞中FOXC1 mRNA相对表达量及Western Blot检测四组细胞中FOXC1表达情况Figure 1 The relative expression of FOXC1 mRNA detected by RT-PCR and the expression of FOXC1 protein detected by Western blot

2.转染48 h后，PCR检测FOXC1mRNA的表达情况：各种的相对表达量见表1，其中转染FOXC1特异性shRNA组与阴性对照组、对照组相比较，FOXC1的mRNA相对表达量显著降低，差异具有统计学意义。

表1 FOXC1基因在各组中的表达情况Table 1 The expression of FOXC1 gene in three groups of

A: Observation results of ordinary light microscope； B: Observation results of green fluorescence microscope；C: Fusion diagram of A and B图2 荧光显微镜下观察HeLa-FOXC1(-)细胞系(放大倍数，×10倍)的荧光显示转染情况Figure 2 The transfection of -FOXC1 (-) cell line was observed under fluorescence microscope (magnification, ×10)

3.转染48 h后Western Blot检测转染后三组细胞中FOXC1蛋白水平表达：转染48 h后分别提取感染阴性组细胞HeLa、感染空载体组细胞HeLa-GFP以及感染FOXC1 shRNA组细胞HeLaFOXC1(-)的总蛋白，通过Western blot方法检测三种细胞中FOXC1蛋白的表达差异，GAPDH作为内参，结果可见HeLa-FOXC1(-)组细胞内FOXC1蛋白的表达明显降低(P<0.01)。见图3。

图3 三组细胞中FOXC1蛋白相对表达情况Figure 3 The relative expression of FOXC1 protein in three groups

三、3组细胞Transwell迁移及侵袭实验结果

1.使用Transwell小室24 h后检测HeLa细胞系，GFP稳定株和FOXC1的干扰稳定株的细胞迁移情况：迁移结果显示，敲减FOXC1基因后三组细胞迁移能力比较， HeLa-FOXC1(-)组细胞迁移能力明显下降(P<0.05)，HeLa组与 HeLa-GFP组无明显差异。见图4。

图4 Transwell小室24 h后三组细胞迁移情况(×40)Figure 4 Cell migration of crystal violet staining of shFOXC1 and control group cells that crossed the polycarbonate membrane of the Transwell chamber (×40)

2.用Transwell小室24 h时分别检测HeLa细胞系，GFP稳定株和FOXC1的干扰稳定株的细胞侵袭情况：Transwell侵袭实验结果显示，敲减FOXC1基因后三组细胞侵袭能力比较， HeLa-FOXC1(-)组细胞侵袭能力明显下降(P<0.05)，HeLa组与 HeLa-GFP组无明显差异。见图5。

图5 Transwell小室24 h后三组细胞侵袭情况(×40)Figure 5 Cell invasion of crystal violet staining of the shFOXC1 and control group cells that crossed the Matrigel-coated polycarbonate membrane of the Transwell chamber to (×40)

四、Western blot检测感染前后各组细胞 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达情况

由图6所示，A:使用WB法检测HeLa细胞系，GFP稳定株和FOXC1的干扰稳定株中E-cadherin,β-catenin和vimentin的蛋白表达情况；B：使用WB法检测HeLa细胞系，GFP稳定株和FOXC1的干扰稳定株中E-cadherin的蛋白表达情况统计结果(P<0.05)；C：使用WB法检测HeLa细胞系，GFP稳定株和FOXC1的干扰稳定株中β-catenin的蛋白表达情况统计结果(P<0.05)；D：使用WB法检测HeLa细胞系，GFP稳定株和FOXC1的干扰稳定株中vimentin的蛋白表达情况统计结果(P<0.05)。结果可见，HeLa-FOXC1(-)组细胞内β-catenin及Vimentin蛋白的表达明显降低，E-cadherin蛋白的表达有增高。

图6 Western blot检测感染前后各组细胞中 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达情况及各组细胞中蛋白的相对表达量Figure 6 The expression of protein and the relative expression quantity ofβ-catenin, E-Cadhenrin and Vimentin detected by Western blot

讨 论

侵袭和转移是肿瘤临床治疗的难题及肿瘤患者死亡的主要原因。恶性肿瘤中上皮-间质转变现象的发生是引起肿瘤远处转移的关键步骤。EMT出现的分子标志为N-cadherin、Fibronectin与Vimentin这3类间质标志物表达的提升，β-Catenin与E-cadherin这2类上皮标志物表达的缺失或降低[12-14]。本课题组前期研究中发现，FOXC1基因在宫颈癌患者的临床病理中高表达，且随着期别进展，FOXC1基因的表达有明显增高，差异有统计学意义。本研究主要通过慢病毒RNA干扰技术，敲减宫颈癌HeLa细胞中FOXC1基因的表达，并通过倒置荧光显微镜及PCR、Western Blot方法验证在HeLa-FOXC1(-)细胞中，FOXC1基因的mRNA及蛋白水平明显降低，通过细胞培养技术获得稳定沉默FOXC1的细胞系，通过Transwell迁移及侵袭实验验证，感染FOXC1-shRNA组细胞的迁移及侵袭能力明显降低，进一步通过Western blot检测三组细胞中β-catenin、E-cadherin及Vimentin的表达，发现FOXC1敲除组细胞系内β-catenin及Vimentin蛋白的表达明显降低，E-cadherin蛋白的表达有增高，进一步验证敲除FOXC1基因的宫颈癌细胞后，下调上皮-间转化(EMT)过程中与转移有关蛋白(β-catenin、Vimentin)的表达，并增加钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，使其侵袭及转移能力随之下降。由此可见，FOXC1和EMT在宫颈癌发展过程中有一定作用，其异常表达可能作为宫颈癌检查新的标志物。

宫颈癌是女性非常常见的妇科癌症之一，现全世界范围内每年仍有超过30万人因此病死亡[2]，当前形势下其具体病因及发病机制仍不明确。临床上，宫颈癌的进展是从局部浸润、侵犯周围器官及淋巴结转移与远处转移，其特点是早期可发生淋巴结及远处转移。据报道，无淋巴转移的宫颈癌患者5年生存率为82.3%，有淋巴转移的5年生存率为50.8%[15]。因此，控制肿瘤的侵袭转移是提高宫颈癌患者生存率的主要方法之一[16-17]。肿瘤的基因靶向治疗是未来癌症治疗的主要手段，在不久的将来，相信FOXC1有望成为宫颈癌治疗的新靶点。