激光辅助孵化对冻融双胚胎移植后胚胎存活及双胎子代发育的影响

金珍　徐维海　吴香丽　张岭　夏美　李施施　张琳　吴丽梅　舒静

[關键词] 子代发育;体外受精;冻融胚胎移植;激光辅助孵化

[中图分类号] R321.3          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2021）23-0096-05

Effects of laser-assisted hatching on embryo survival and twin progeny development after freeze-thaw double embryo transfer

JIN Zhen   XU Weihai   WU Xiangli   ZHANG Ling   XIA Mei   LI Shishi   ZHANG Lin   WU Limei   SHU Jing

Department of Reproductive Endocrinology， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou   310014， China

[Abstract] Objective To evaluate the effects of LAH on embryo survival and neonatal and infant development by analyzing the embryo survival， twin neonatal development and 1-year-old infant development after double embryo transfer at？D3？cleavage of freeze-thaw from laser-assisted incubation（LAH）. Methods A total of 843 infertility patients with double embryo transfer who were admitted to Zhejiang Provincial People's Hospital from January 2017 to December 2019 were selected and divided into the LAH group（n=381） and the non-LAH group（n=462） according to the need for laser-assisted incubation（LAH） before transplantation. LAH treatment was used before transplantation in the LAH group， while no LAH treatment was used before transplantation in the non-LAH group. The pregnancy outcomes of the two groups were compared， and 156 patients with twin embryo survival（including 65 patients in the LAH group and 91 patients in the non-LAH group） were selected for the twin progeny growth and development indicators， including the gestational age at birth， weight， malformation， height and weight at the first year of life， etc.， to analyze the long-term effects of LAH on the development of embryos and infants. Results No significant difference was observed in the embryo survival rate between the LAH group and the non-LAH group（P>0.05）. No significant differences were observed in the birth weight of A， birth weight of B and the proportion of congenital malformation between the LAH group and the non-LAH group（P>0.05）. No abnormalities were observed in height， weight， cognition， teething and motor ability of twins in the two groups at the age of 1， and the differences were not statistically significant（P>0.05）. Conclusion The application of LAH has no significant influence on the embryo survival rate， the development of twin babies and the development of infants at the age of 1 after the freeze-thaw double embryo transfer. The influence of LAH on the deformities rate of twin babies is still needed to be studied in more cases.

[Key words] Progeny development; In vitro fertilization; Freeze-thaw embryo transfer; Laser-assisted hatching

体外受精-胚胎移植（In vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）是不孕不育患者的主要助孕方法之一。胚胎着床是IVF-ET的关键环节，分为囊胚的孵化、定位、黏附和侵入四个环节，囊胚的成功孵化是胚胎植入的重要前提。在辅助生殖治疗过程中，使用促排卵药物、胚胎体外培养及冷冻-复苏过程等均可导致透明带硬化或增厚，引起囊胚孵化失败而不能着床[1]。对于处于冻融胚胎移植（Frozen thawed embyo transfer，FET）周期的患者，为了囊胚孵化率和胚胎种植率的提升，通常可对早期胚胎行透明带削薄或打孔辅助孵化（Assisted hatching，AH）[2]，操作的方法包括机械法、酶消化法、化学法、激光辅助孵化（Laser-assisted hatching，LAH）等[3]。20世纪90年代早期， 激光打孔和激光薄化等非接触性激光脉冲对胚胎透明带的辅助孵化处理已开始应用。与其他辅助孵化技术相比，激光法可更有效提高孵化率，且安全和方便，是最常用的辅助孵化技术之一[4]。LAH常用1480 nm的远红外波长，远离核酸的吸收峰260 nm，避免对DNA造成损伤[5]。然而由于LAH采用高能量操作，其安全性是长期备受关注的问题。另外，经LAH作用的囊胚孵出与自然状态下的囊胚孵出的机制也有较大的差异[6]，其对于出生后代的影响鲜有报道。目前少数已有的研究认为，LAH对单胚胎移植的妊娠结局及出生后1年内子代发育无明显影响[7]，但对于孕期潜在风险更高的双胚胎移植还未有报道。在试管婴儿助孕过程中，部分医师或患者在胚胎移植过程中为提高妊娠率而选择双胚胎移植，使多胎妊娠率上升，同时也造成新生儿早产、低出生体重等健康风险的增加，而此时LAH对于胚胎发育及新生儿的潜在影响可能会更容易显示出来。为探讨LAH对于冻融双胚胎移植后胚胎存活率及双胎子代发育的影响，本研究收集843例D3双胎胚移植的患者，并对胚胎存活情况及156例双胎分娩的子代出生时及出生后1年的数据进行统计分析，对LAH在辅助生殖治疗中使用的安全性进行详细评估，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月至2019年12月在浙江省人民医院生殖医学中心接受D3双胚胎移植的843例及妊娠结局为双胎分娩的156例FET周期资料，回顾性分析LAH操作对双胚胎移植后胚胎存活及双胎新生儿和后续婴幼儿生长发育的影响。根据是否对移植前的胚胎行辅助孵化操作，将研究对象分为两组，LAH组381例，胚胎复苏后行LAH后进行双胚胎移植;非LAH组462例，胚胎复苏后未行LAH，直接行双胚胎移植。另外，妊娠结局为双胎分娩的研究对象共156例，也分为两组，LAH组65例，非LAH组91例。该研究经医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。纳入标准：①行 IVF-ET治疗并成功临床妊娠;②胚胎移植数目为2个;③有IVF-ET治疗的详细信息、妊娠结局及婴儿生长发育情况记录[8]。排除标准：①胚胎移植数量为1个或>2个;②IVF-ET治疗的详细信息、妊娠结局记录或婴儿生长发育情况记录不详;③行IVF-ET但未能成功临床妊娠[8]。

1.2方法

1.2.1  胚胎复苏、LAH及胚胎移植  胚胎玻璃化冷冻和复苏的操作均在37℃环境下进行，冷冻及复苏操作均按照Vitrolife公司的玻璃化冷冻及复苏试剂盒的说明书进行。胚胎复苏后在倒置显微镜下进行LAH（Octax Laser Shot System，Vitrolife，Germany）操作，该激光参数为：近红外二极管波长1480 nm，聚焦能量150 J，激光脉冲长度2.6 ms。操作部位选择胚胎与透明带间隙最宽处。依次发射激光（激光能量）削薄但不穿透胚胎透明带，削薄区域为透明带全长的1/4，削薄深度为透明带厚度的60%～80%。操作完成后将胚胎放置于37℃、5%O2、6%CO2及饱和湿度环境中继续培养直至移植。

1.2.2 随访  由专业随访护士以电话问卷调查形式进行。随访项目包括新生儿出生时患者的孕龄、新生儿出生体重及出生缺陷等，生长发育的随访于出生1周年后进行，随访后代生长至1周岁为止的情况，包括身高及体重数据、出牙数目及出牙时间、运动能力、智力水平的评估。该随访表的Cronbach′s α系数值为 0.884>0.7，提示该随访的信度较好。问卷回收率为100%。

1.2.3 新生儿、婴幼儿体格生长发育标准  新生儿出生体重<2500 g为低体重儿，孕周不足37龄为早产。周岁婴幼儿发育情况如身高、体重的评估以《中国7岁以下儿童生长发育参照标准》为参照[9]，周岁男童正常身高范围为68.6～85.0 cm，周岁女童为67.2～83.4 cm，低于该范围者为身高发育迟缓，高于该范围者为身高偏高;周岁男童正常体重范围为7.21～12.54 kg;周岁女童为6.87～11.73 kg，低于该范围者为体重偏轻，高于该范围者为体重偏重。周岁婴幼儿正常乳牙萌出数量4～6颗[10]，周岁乳牙未萌出者为乳牙迟萌。运动及心智根据WHO 0～6岁儿童体格发育評估参考标准进行评估[11]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，不符合正态分布者经过变量转换为正态分布后行统计学分析;计数资料结果以[n（%）]显示，组间比较采用Pearson χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全部研究对象及妊娠结局为双胎分娩研究对象的临床基础资料比较

本研究共纳入843例研究对象，其中LAH组381例，非LAH组462例。LAH组女方年龄（32.13±3.41）岁，与非LAH组（31.55±3.11）岁比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组间不孕类型、不孕年限、不孕指征及受精方案比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。另外，本研究妊娠结局为双胎分娩的研究对象共156例，其中LAH组65例，非LAH组91例。 LAH组女方年龄（31.63±4.19）岁，与非LAH组（30.35±3.51）岁比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组间不孕类型、不孕年限、不孕指征及受精方案比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2两组胚胎存活情况比较

双胚胎移植后妊娠的两组患者共843例作为研究对象，统计对比两组移植后妊娠结局。LAH组与非LAH组患者活胎数为0个的比例分别为30.97%和28.57%，活胎数为1个分别为51.97%和51.73%，活胎数为2个的比例分别为17.06%和19.70%，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.3 两组双胎新生儿出生时参数比较

双胚胎移植后妊娠结局为双活胎的两组患者共156例作为研究对象，统计对比两组间新生儿（共312例）出生时的参数。两组患者早产率、A胎新生儿（共156例）出生体重、B胎新生儿（共156例）及总体新生儿（共312例）出生体重、低体重儿比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。LAH组双活胎出生孕龄为（36.55±1.48）周，长于非LAH组的（35.89±2.17）周，差异有统计学意义（P<0.05）。LAH组共有2例新生儿畸形，分属两组患者双胎后代之一，1例为先天性喉结缺如，1例为心脏房间隔缺损，畸形率为1.54%，而非LAH组出生1例畸形新生儿，为室间隔缺损，畸形率为0.55%，组间比较差异无统计学意义（P>0.05），但均低于国内多中心研究报告的出生缺陷发生率（5.6%）。见表4。

2.4 两组双胎婴幼儿周岁参数比较

双胚胎移植后妊娠结局为双活胎的两组新生儿共312例作为研究对象，统计对比两组间双胎婴幼儿周岁时的参数。双胎婴幼儿周岁体重均无异常，LAH组周岁身高无异常，非LAH组有2例身高发育迟缓（1.10%）。所有随访者的体重、运动能力、出牙情况、智力评估均未见异常。见表5。

3讨论

透明带是包绕在哺乳动物卵子或早期胚胎周围由糖蛋白构成的膜状物质，在精卵识别和早期胚胎发育中起重要的作用。有研究提示，长时间的体外培养及胚胎的冷冻复苏等操作可使得透明带硬化，影响后续囊胚的孵化，造成着床失败，是FET周期失败的主要原因之一。

多项研究显示，采用LAH对胚胎进行移植前透明带消融，可以提高治疗周期的胚胎着床率和临床妊娠率[12]，目前已经是FET周期的常规备选方案。由于LAH的热效应存在胚胎损伤的潜在风险，其安全性仍有争议[5]。本研究曾对FET周期中使用LAH后单胚胎移植并成功妊娠的患者进行新生儿和1岁龄婴幼儿的生长发育状况进行研究，结果显示LAH后单胚胎移植后单胎新生儿及1岁龄婴幼儿的发育状况良好，与非LAH移植的患者并无明显差异，初步表明LAH在FET中常规使用的安全性。而LAH对双胚胎移植后双胎妊娠并活产婴幼儿的影响还鲜有报道。

有研究显示，在试管婴儿助孕患者双胚胎移植后，其分娩双活胎的比例达到24.07%，分娩单活胎的比例为58.98%，无活胎比例则为16.96%，活胎率明显高于单胚胎移植[12-14]，表明与单胚胎移植相比，双胚胎移植的患者能够顺利生产至少1个活产胎儿的概率明显提高。但与此同时，双胚胎移植引起不良妊娠结局的比例也明显高于单胚胎移植[15-17]。与单胚胎移植7.64%的早产率相比，双胚胎移植患者分娩新生儿早产的比例增至17.64%，且显著高于国家卫生健康委妇幼司报告的数据（约7%）[8]。同时，双胚胎移植出生婴儿低出生体重的比例也高于国家卫生健康委妇幼司“低出生体重发生率控制在4%以下”的要求。单胚胎移植患者分娩的新生儿早产率及低出生体重率则与自然受孕者无明显差异[5]。另外，研究显示，单胚胎移植患者分娩的新生儿出生缺陷发生率分别为1.57%，而双胚胎移植患者的则为1.64%，均低于国内多中心研究报告的新生儿出生缺陷发生率（5.6%）[9]。

可见，双胎妊娠属于高危妊娠，与单胎相比有着更高的早产及低出生体重风险，LAH对于胚胎发育的潜在影响也更容易显现。然而，为了提高临床妊娠率，改善妊娠结局，双胚胎移植往往是很多医生与患者的共同选择。既往研究提示，对于双胚胎移植的患者，LAH组着床率与双胎率相对非LAH组有明显提升[5]。本研究选择LAH组和非LAH组胚胎移植的患者为研究对象，统计比较两组胚胎存活情况;并选择妊娠结局为双胎活产的患者作为研究对象，统计比较两组间双胎新生儿及1岁龄婴幼儿的发育状况。结果显示，LAH组与非LAH组患者活胎数为0个的比例分别为30.97% vs. 28.57%、活胎數为1个分别为51.97% vs. 51.73%、活胎数为2个的比例分别为17.06% vs. 19.70%，差异无统计学意义（P>0.05）。妊娠结局为双胎活产的患者，LAH组双胎新生儿出生孕龄长于非LAH组，早产率分别为33.85%、36.26%。LAH组与非LAH组的A胎、B胎及总体新生儿的出生体重分别（2669.69±642.38）g vs. （2556.98±468.93）g、（2597.46±553.52）g vs. （2510.7±490.95）g及（2633.58±585.70）g vs. （2533.86±475.71）g，与国内报道的活产双胎出生体重（2.50±0.53）kg基本一致[18]。本研究结果显示，LAH组出生的双胎新生儿总体低体重儿率为19.23%，非LAH组为21.98%，组间比较差异无统计学意义（P>0.05），略低于先前研究中双胎新生儿低体重率，分析可能与双胎剖宫产孕龄选择有关[19]。另外，本研究结果显示，LAH组与非LAH组的双胎新生儿畸形率分别为1.54%、0.55%，差异无统计学意义（P>0.05），且均显著低于2012年报道的我国出生缺陷率5.6%[15]，与报道的双胚胎移植新生儿1.64%的出生缺陷率相仿[9]，Shats等[16]的研究认为，LAH不增加新生儿的围产期风险，本研究之前的单胚胎移植后出生新生儿的结果也显示，LAH组与对照组新生儿畸形率比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示LAH组双胎新生儿畸形率并未高于既往标准，但未来需增加研究病例数量获得更为准确可靠结果。

本研究曾对单胚胎移植后单胎活产的试管婴儿1周岁发育情况进行随访，结果显示，两组双胎婴幼儿周岁体重均无异常，LAH组周岁身高无异常，非LAH组有2例身高发育迟缓（1.10%）。所有随访者的体重、运动能力、出牙情况、智力评估均未见异常。此前的一项单胚胎移植后单胎活产的前瞻性队列研究也表明，ART后出生的婴儿与自然受孕出生的婴儿在2周岁时的认知、运动和语言能力方面比较无明显差异[20]。本研究的研究对象为双胚胎移植后双胎活产的试管婴儿，结果提示即使是双胎妊娠的试管婴儿，LAH也不会引起婴幼儿发育迟缓或发育异常。

综上所述，对双胚胎移植后双胎分娩的试管婴儿研究中，LAH的应用对双胚胎移植着床后胚胎存活情况及双胎分娩的新生儿发育、1周岁婴幼儿发育均无明显影响，对于双胎新生儿畸形率的影响尚需更多病例的研究。至于LAH对双胎分娩子代发育的长期影响，课题组也将长期关注。另外，本研究对于患者的吸烟、居住环境、饮食等信息未予区分，因此上述因素是否对胚胎着床成功率、妊娠结局及婴幼儿正常发育造成一定影响尚未可知，在后续研究中将考虑更多变量对结局指标造成的影响。

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（收稿日期：2021-02-22）