EGCG在抗鼻咽癌中对MMP-2表达的抑制作用

王文华　刘观成　李振亚　何晓松　刘强和　李思维

[關键词] EGCG;MMP-2;鼻咽癌;侵袭;转移

[中图分类号] R739.63          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）23-0035-04

Inhibition effect of EGCG on expression of MMP-2 in anti-nasopharyngeal carcinoma

WANG Wenhua1   LIU Guancheng1   LI Zhenya1   HE Xiaosong1   LIU Qianghe2   LI Siwei3

1.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，China; 2.Institute of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Guilin Medical University，Guilin   541001，China; 3.School of Clinical Medicine of Guilin Medical University，Guilin   541001，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of epigallic acid catechin gallate （EGCG） on the expression of MMP-2 gene in nasopharyngeal carcinoma cells，and to reveal the mechanism of EGCG in anti-nasopharyngeal carcinoma. Methods CNE2 cells of poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma cell line were cultured in 5%CO2， 37°C for 48 hours， and grouped according to different concentrations of EGCG （0， 40， 80， 160 mg/L）. MTT method was used to detect the proliferation inhibition rate of cultured cells in each group. Transwell invasion assay was used to detect the invasiveness of CNE2 cells after EGCG treatment. Semi-quantitative reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect the MMP-2 mRNA expression in cells. Western blot was used to detect the protein expression in cultured cells. Results The results of MTT and Transwell invasion experiments suggested that with the increase of EGCG concentration and time of action，the proliferation and invasion ability of CNE2 cells were significantly weakened， compared with the corresponding control group at three different time points after different concentrations， the difference was statisticolly significant （P<0.05）. The degree of gradual inhibition showed a dose-dependent and time-dependent relationship. Semi-quantitative reverse transcription PCR （RT-PCR） and Western-Blot test results showed that with the increase of EGCG concentration and time， MMP-2 mRNA expression and MMP-2 protein expression showed a downward trend（P<0.05）. Conclusion EGCG can reduce the invasion and metastasis of CNE2 cells by inhibiting the expression of MMP-2 in CNE2 cells， to achieve the anti-nasopharyngeal carcinoma effect.

[Key words] EGCG; MMP-2; Nasopharyngeal carcinoma; Invasion; Metastasis

鼻咽癌是我国南部省份高发的恶性肿瘤。好发于鼻咽部，位置掩蔽，早期很难发现，且易于转移，传统的化疗药带来一定疗效的同时，也给人体的正常细胞和器官带来了巨大的损害[1-3]，因此寻找一种高效低毒的药物配合放疗提高鼻咽癌患者的疗效具有重要的意义。

表没食子酸儿茶素没食子酸酯[（-）-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]是绿茶中的主要提取物。国内外大量的流行病学研究及体内外实验证实，其对多种肿瘤细胞均具有抑制作用，并对正常细胞无明显毒副作用，但其作用机制不是很清楚[4]。前期研究发现，EGCG具有抑制鼻咽癌细胞增殖、诱导其凋亡、提高放疗效果的作用。尽管国内外均对EGCG进行大量研究，但其具体作用机制及相关作用靶点仍需要进一步研究。本研究旨在探讨不同浓度EGCG对鼻咽癌细胞CNE2增殖、侵袭和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响。为进一步探讨EGCG的抗鼻咽癌作用机制，为鼻咽癌的防治提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

EGCG（純度≥98%）、PI、RNA酶均购自美国Sigma公司，CNE2细胞株由桂林医学院科学实验中心提供，小牛血清购自杭州四季生物工程材料有限公司，胰酶-EDTA、RPMI-1640（Gibco公司），Matrigel基质胶（BD公司），Transw Transwell小室（3428型）（Corning公司），cDNA第一链试剂盒及PCR试剂盒（艾德莱公司），β-actin及MMP-2引物（由Invitrogen公司设计合成）。鼠抗MMP-2单克隆抗体、鼠抗β-actin 单克隆抗体及辣根过氧化酶标记二抗（购自北京中杉金桥公司）。EGCG与PBS液配制浓度为10 mg/L，后经微孔过滤器（0.22 μm）过滤，分装保存于4℃冰箱中。

1.2 CNE2细胞的培养与EGCG作用

以含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，5%CO2的培养箱中37℃培养48 h，取对数生长期生长旺盛的细胞，细胞混液密度调配至2.0×105/mL，接种于96孔板，每孔0.2 mL细胞混液。再于5%CO2培养温箱中培养24 h后换液，再添加入EGCG（0、40、80、160 mg/L）处理板孔中的细胞，每组浓度重复5个复孔。

1.3 MTT法检测CNE2细胞增殖抑制情况

不同浓度EGCG分别干预CNE2细胞24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续于温箱中培养4 h后弃上清，各孔依次加入DMSO 200 μL，振荡操作10 min至充分溶解结晶，置96孔板于酶标仪上测A490 nm处的吸光值，统计各组细胞作用后的增殖抑制率并绘制增殖抑制曲线。

1.4 EGCG对CNE2细胞侵袭能力的影响

室温下向Transwell侵袭试剂盒的侵袭小室上侧面加入预热的无血清培基300 μL，水化基底膜1.5 h左右;取对数生长期的细胞，密度调整至1×106/L;吸弃上室面无血清培养基，下室中加入500 μL RMPI-1640培养基（含10%小牛血清），然后上室面中加入300 μL含0 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L EGCG的细胞悬液，于5%CO2培养箱37°C孵育60 h后，无菌棉签擦拭去小室里Matrigel胶及未穿透的细胞，在24孔板中加入 0.1%的结晶紫500 μL，染色20 min，去离子水清洗2遍后自然晾干。倒置荧光显微镜下察看、照片，10×光镜下统计穿透每个小室膜背面的细胞数，随机选取四周和中间共5个视野计数。

1.5 RT-PCR检测EGCG处理后CNE2细胞MMP-2的表达

EGCG（0、40、80、160 mg/L）分别作用CNE2细胞24 h、48 h、后，Trizol试剂裂解细胞提取其中总RNA，凝胶电泳检测其完整性。然后逆转录总RNA至cDNA第1链，再进行PCR扩增MMP-2基因。MMP-2引物设计的上游序列为：5c-GAATGCCATCCCCGATA ACC-3c，下游序列为：5c-GCCAGCTCAGCAGC CTA-3c，产物大小是160 bp;内参β-actin引物设计的上游序列为5c-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3c，引物设计的下游为5c-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3c，产物大小是416 bp，为美国Invitrogen公司设计并合成。根据试剂盒说明书进行逆转录反应体系的组建，进行PCR扩增：取2 μL cDNA 样本，依次加入12.5 μL Mix，8.5 μL ddH2O，1 μL Forward Primer，1 μL Reverse primer。慢速离心进行混匀后，按下列步骤进行设置：94℃预变性处理5 min后，94℃变性处理30 s，55℃退火处理30 s，72℃延伸处理45 s，以上步骤共循环35次，最后72℃延伸操作 7 min。选择β-actin作为内参对照，EGCG不同浓度组产物各取5 μL于1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测。凝胶分析系统扫描检测各带灰度值，测定各组细胞中MMP-2的相对表达水平。

1.6 Western-Blot检测 EGCG处理后CNE2细胞中MMP-2蛋白的表达

不同浓度EGCG（0、40、80、160 mg/L）处理CNE2细胞48 h后，提取细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳，半干转印，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入第1抗体（MMP-2 1∶500，β-actin 1∶500）4℃过夜，PBST洗膜后加入1∶5000稀释的兔抗鼠第2抗体孵育1 h，PBST洗膜后，ECL显色曝光，经自动电泳凝胶分析系统扫描并测定蛋白条带积分密度值（IDV），以上实验重复3次，将目的蛋白IDV/β-actin IDV平均值作为MMP-2蛋白水平表达值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理。计量资料以（x±s）表示，多样本均数比较应用单因素（One-ANOVA）方差分析，组间比较采用t检验，两两组间比较分析采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG作用后CNE2细胞的增殖抑制情况

EGCG（0、40、80、160 mg/L）干预CNE2细胞24 h、48 h、72 h后，不同EGCG浓度的三个不同时间点与相应的对照组相比，鼻咽癌CNE2细胞增殖明显抑制（P<0.05）;且随着EGCG作用浓度的增高和作用时间增加，其增殖抑制作用越明显，并呈现出一定的剂量-效应和时间-效应关系。见封三图3。

2.2 EGCG对CNE2细胞侵袭作用的影响

随着EGCG作用浓度的增加，CNE2细胞侵袭穿透的能力显著下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图4。

2.3 EGCG作用后CNE2细胞MMP-2 mRNA与蛋白的表达变化

加入EGCG（0、40、80、160 mg/L）于CNE2细胞中，继续培养24 h、48 h后，随着EGCG作用浓度和时间的增加，MMP-2 mRNA表达趋势性下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。EGCG作用48 h后，MMP-2的蛋白表达呈现出明显的随EGCG浓度的增加而下降的趋势（P<0.05）。见图2、表2。

3 讨论

茶多酚作为生活中最常见的绿茶提取物，其主要活性成分便是EGCG。大量研究证实，EGCG具有抗多种肿瘤的作用[4-7]，且对正常组织细胞无明显毒害作用[8]。其抗肿瘤的作用机制尚未明晰，可能与阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、诱导其凋亡、抑制相关信号通路的激活等有关[9-11]。本实验通过观察不同浓度的EGCG对低分化鼻咽癌细胞株CNE2的生长增殖的影响后证实，EGCG能抑制CNE2生长增殖，并发现随着药物浓度的增加和时间的增长呈抑制增强趋势;通过细胞侵袭实验结果发现，EGCG能够抑制CNE2细胞的侵袭转移，抑制作用随着EGCG浓度的升高呈正相关。

基质金属蛋白酶（Matrixmetal-loproteinase，MMPs）是锌离子依赖性内切酶性蛋白酶家族，能够通过降解细胞外基质（Extra cellular matrix，ECM），在肿瘤细胞的侵袭破坏及转移过程中起到至关重要的作用[12]。在体内，MMPs主要通过降解间质溶素、明胶酶、间质胶原酶等细胞外基质的成分，促使肿瘤细胞越过由细胞外基质构成的组织结构屏障，向周边组织结构、血管及淋巴管等其他区域侵袭转移[13]。目前发现的基质金属蛋白酶家族有二十多个种类，MMP-2是目前研究的最为广泛且最重要的一种侵袭性因子[14]，其在肿瘤细胞的浸润和转移、新生血管等恶性特征中发挥着十分重要的作用[15-16]。有研究显示[17]，MMP-2的表达促进了肿瘤的侵袭性和不良预后，并诱导了鼻咽癌上皮间质转化的发生。苏勇等[18]通过检测229例鼻咽癌患者的石蜡标本发现，MMP-2在鼻咽炎症组织中阴性表达，而在鼻咽癌组织中的总表达率为52.0%;其中，T3～4高于T1～2（P<0.01），且有淋巴结转移及远处转移患者的表達高于无淋巴结转移者（P<0.01），N2～3高于N1（P<0.05），N2、N3与M1相当（P>0.05），提示MMP-2的表达与鼻咽癌浸润转移及严重程度密切相关。另有研究证实[19]，利用小分子干扰RNA技术，通过降低PI3K/AKT信号通路下调MMP-2的表达后，从而抑制了鼻咽癌的侵袭和转移。另有研究提示，EGCG经信号通路下调EGFR的表达，从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移[20]。在证实EGCG呈浓度依赖性减弱CNE2细胞的浸润作用后，利用RT-PCR及West-Blot技术检测了CNE2细胞中MMP-2的表达情况，发现随着EGCG浓度的增高和时间的增长，MMP-2 mRNA与蛋白的表达呈剂量-效应、时间-效应性下降（P<0.05），提示EGCG抑制CNE2细胞侵袭转移的机制可能与抑制MMP-2的表达有关。

综上所述，EGCG抑制CNE2细胞的增殖、减弱其侵袭转移能力，发挥其抗鼻咽癌的作用机制与下调MMP-2 的表达相关。EGCG的抗癌作用机制的探索是一个复杂并持续探索的过程，其具体通过哪些信号通路的调节从而影响MMP-2及其他相关基因及蛋白表达，还需要进一步的研究。这些结果将会进一步增加EGCG作为抗癌药物的理论依据。

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（收稿日期：2021-04-23）