一株产果香型真菌的筛选、鉴定及在烟草增香中的应用

张鹏，李炜，师超，高加明，任杰，申国明，张忠锋

摘  要：烟叶香气不足一直制约着烟叶品质及其工业可用性。为开发新的烟草香料，本研究从湖北省利川市烟草种植区的烟叶中筛选到产果香型菌株R59，经鉴定为产黑色素短梗霉Aureobasidium melanogenum。发酵后，该菌株能够产生11种香气化学物质，其中果香型的苯乙醇、苯乙醛和醋酸异戊酯的浓度均超过100 μg/mL。对发酵培养基进行优化，发现以30 g/L的葡萄糖作为碳源，15 g/L玉米浆作为氮源，培养基pH为5.0条件下培养R59菌株，可有效提高菌株中苯乙醛和醋酸异戊酯的产量。喷洒10 μL/g R59菌株发酵液可有效改善烟丝的协调性、香气和余味。R59菌株产香发酵成本低，添加工艺简单，可以作为一种提高烟草品质的香料来源。

关键词：果香型真菌;烟草;增香;感官评价

Screening and Identification of a Fungus with a Sweet Fruit Aroma and Its Application in Flavoured Tobacco

ZHANG Peng1， LI Wei2， SHI Chao3， GAO Jiaming4， REN Jie1， SHEN Guoming1， ZHANG Zhongfeng1*

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Shanghai Tobacco Group Beijing Cigarette Factory Co.， Ltd. Beijing 101121， China; 3. Lichuan Branch of Enshi Tobacco Company， Lichuan， Hubei 445400， China; 4. Hubei Provincial Tobacco Company of China National Tobacco Corporation， Wuhan 430000， China）

Abstract： Insufficient aroma of tobacco leaves has always been a major factor limiting the quality of tobacco leaves and their industrial availability. In order to develop a new source of spices， the R59 strain with a sweet fruit aroma was isolated from healthy leaves of tobacco collected from Lichuan， Hubei province. This strain was identified as Aureobasidium melanogenum. In this study， eleven aroma components were detected in the fermentation broth. Among them， phenylethyl alcohol， phenylacetaldehyde， and isoamyl acetate， which possessed fruity arama， were produced more than 100 μg/mL. After fermentation medium optimization， the production of phenylacetaldehyde and isoamyl acetate by the R59 strain was increased significantly when cultured in 30 g/L glucose， 15 g/L corn steep liquor at pH 5.0. Spraying of the fermentation broth onto cut tobacco at a dosage of 10 μL/g could effectively improve its coordination， aroma and aftertaste. Due to its low fermentation cost and simple addition process， the R59 strain can be used as an aroma source to significantly improve the quality of cigarette products.

Keywords： fruity fungi; tobacco; fragrances enhancement; sensory evaluation

煙草是我国重要的经济作物之一。卷烟的香气品质直接影响消费者的吸食口感，是评价卷烟产品的重要指标。提高卷烟的香气品质有多种方法，如选育高香品质的烟草品种[1]、改善烟草的栽培模式[2]及在卷烟加工过程中添加香料[3]等。其中外源添加香料在卷烟加工中最为常用，可以直接、有效地提升卷烟的香气品质，掩盖烟叶的刺激性和杂气。但是，外源添加香料目前主要以化学合成为主，合成过程中产生的废弃物和潜在有害物质会造成环境污染。因此，研发绿色、环保的新型香料，替代化学合成的卷烟香料，对于烟草香料行业的健康发展至关重要。

自然界中有多种微生物能够产生香气物质，为新型天然源香料的开发提供了途径[4]。微生物产香种类丰富，细菌类的枯草芽孢杆菌能够产生乙醇、乙酸乙酯等，呈现醇香、果香和甜香等特征性香气;地衣芽孢杆菌能产生草酸、甲酸乙酯、丙酮醛等，呈现辛香、蜂蜜香、醋酸香和酱香等特征性香气[5];真菌类如东方伊萨酵母能够合成特殊的酯类物质，产生蟠桃香;毕赤酵母高产乙酸乙酯，可增加果香[6];酿酒酵母和毕赤酵母混合发酵产生花香果香，尤其是热带水果型香气;马克斯克鲁维酵母能产生高达400 mg/L的苯乙醇[7]，该物质具有典型的玫瑰香气，常作为烟草香料的重要组分[8-9]。

微生物发酵产香具有生产周期短、对环境友好等特点，已在白酒[10]、食醋[11]、酱油、腐乳、豆豉等加工行业中得到应用。国内对烟叶产香微生物的研究起步较晚，目前尚未建立起适合发酵生产卷烟香料的微生物群落结构体系。本研究从烟草植株上筛选产香的微生物，并对关键致香成分和发酵条件进行鉴定和优化，评价其发酵产物在烟草增香中的应用效果，旨在发掘适用于卷烟增香的微生物，丰富烟草行业新型香料的来源，开发具有良好风味的新型烟草制品。

1  材料与方法

1.1  供试材料

供试烟叶于2018年7月采自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市烟草种植区，分别于不同海拔（800、1000和1200 m）产区采集烟草上部、中部和下部烤后叶。

1.2  试剂和培养基

1.2.1  试剂  试验PCR用高保真Phanta酶和DNA提取试剂盒购自于南京诺唯赞生物科技有限公司，扩增DNA片段所用引物和ITS rDNA序列由青岛擎科生物科技有限公司合成，DNA Marker购自于北京全式金生物技术有限公司，培养基配置所需葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉和琼脂等均购自于国药集团化学试剂有限公司，豆饼粉、玉米浆及玉米蛋白粉购自于青岛科瑞培养基有限公司;色谱纯化学试剂甲醇、二氯甲烷、苯乙醛、乙酸苯乙酯、醋酸异戊酯均购自于国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2  培养基  牛肉膏蛋白胨培养基：0.5%（m/v，下同）牛肉膏，1%蛋白胨，1%氯化钠。LB液体培养基：1% NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母粉;固体培养基配置时加入1.5%琼脂。YPD液体培养基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉;固体培养基配置时加入1.5%琼脂。

所有培养基均于115 ℃灭菌30 min后使用，其中LB培养基用于培养细菌，YPD培养基用于培养酵母菌和丝状真菌。

1.3  烟草微生物的分离

称取10 g烟叶样品，剪碎加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放于28 ℃摇床中振荡培养48 h，转速为150 r/min。用血球计数板对培养基中的微生物进行计数，后用无菌水稀释至每微升培养基中微生物个数为1～10。将稀释后的培养液在LB平板上涂布以分离细菌，在YPD平板上进行涂布以分离真菌（包括酵母菌），分别于28 ℃和37 ℃静置培养48 h。挑取菌落形态不同的微生物在固体培养基上划线纯化后，置于30%的甘油中于–80 ℃超低温冰箱中保存。

1.4  产果香微生物的筛选

将筛选到的微生物菌株于摇床中振荡培养48 h后，进行感官质量评价[12]。产香品质的评价指标包括4个方面：香气度、差异度、留香时间、刺激性。差异度由小到大满分10分，香气由弱到强满分20分，留香时间由短暂到持久满分10分，刺激性由大到小满分10分。分数越高，香味品质越好，筛选最佳的产果香微生物。

1.5  果香菌株的鉴定

选取产香赋分值最高的菌株，將其在YPD平板上划线，28 ℃静置培养48 h后，观察其菌落形态和细胞形态[9-11]。设计合成真菌通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，扩增菌株的ITS rDNA序列后送青岛擎科生物科技有限公司测序。测序结果在NCBI上进行Blast比对，在Blast结果的基础上，查找与此菌株进化关系相近的标准菌株的ITS rDNA。基于邻位相接法，构建系统发育树进行种属鉴定。

1.6  发酵液中香气成分的分析

将产香赋分值最高的菌株接于YPD液体培养基中，30 ℃、150 r/min振荡培养48 h。将发酵液离心，取上清液，等体积加入二氯甲烷并混匀。将发酵液萃取有机相减压蒸馏至彻底干燥，然后加入适量二氯甲烷，用于气质联用（GC/MS）分析，气相色谱条件参照文献[9-10]。质谱条件中接口温度280 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;离子化方式EI;电子能量70 eV;质量扫描范围（m/z）35～400。得到的质谱结果与数据库中的已有物质比较，确定化合物种类，再根据峰面积计算各成分的含量和浓度。

1.7  苯乙醛和醋酸异戊酯含量的测定

苯乙醛和醋酸异戊酯含量用HPLC方法测定[13]，色谱柱为Waters 2695和Platisil C18柱（4.6 mm×250 mm）;紫外检测器，检测波长为210 nm;流动相为甲醇-水，梯度洗脱，流速为1 mL/min。根据峰面积，按照标准品标准曲线进行苯乙醛和醋酸异戊酯含量测定。

标准品标准曲线的制定：将色谱纯苯乙醛和醋酸异戊酯分别配制成浓度为10～150 mg/L的工作溶液，使用0.45 μm有机过滤膜过滤，进行HPLC分析，根据峰面积制作标准曲线，得到标准曲线方程。

1.8  发酵产香条件的优化

发酵培养基的优化主要考虑葡萄糖浓度、氮源种类、玉米浆浓度和pH等4个因素对菌株产香的影响，葡萄糖浓度设置为：15、20、25、30、35、40 g/L;氮源选择为蛋白胨和酵母粉、玉米浆、玉米蛋白、（NH4）2SO4、豆饼粉5组;玉米浆浓度设置为10、15、20、25、30、35 g/L;pH设置为4.5、5、5.5、6、6.5、7。先将选取的菌株接种于YPD液体培养基中，放于30 ℃摇床150 r/min振荡培养24 h，得到种子培养液。取5 mL种子培养液接入不同发酵培养基，30 ℃继续振荡培养36 h后，测定发酵液中苯乙醛和醋酸异戊酯含量。

1.9  发酵液增香效果的感官评价

在1.8所述条件下培养产香赋分值最高的菌株，将发酵液用0.45 μm滤膜过滤除菌后均匀喷洒于烟丝表面，喷洒量为5～20 μL/g，后将烟丝放置于25 ℃、65%的湿度环境下平衡6 h，制成烟支。以不喷洒菌株发酵液的烟丝为对照。感官质量由中国农业科学院烟草研究所和颐中（青岛）实业有限公司技术中心评吸专家进行综合评价[14-15]。

2  结  果

2.1  产果香微生物的筛选

从不同海拔、不同部位烟叶中共分离得到细菌69株和真菌57株，作为增香微生物筛选的菌种库。纯化过的菌株在平板划线过程中，通过初步的嗅觉筛选，发现有5株微生物能产生较为明显的果香。5个菌株继续在28 ℃和160 r/min下振荡培养36 h，采用嗅香的方式进行感官评价并赋分比较。如表1所示，A1、R59、A13和B2 四株菌产香均较强，差异度也比较明显，其中R59的产香能力最强;综合停留时间和刺激性，R59菌株得分最高。R59菌株能够产生清甜水果香气，夹杂着一种特殊的玫瑰香味，且香气持久，杂气较轻，故将其用于后续的产香和应用研究。

2.2  菌株鉴定

不同种类的微生物具有不同的菌落和细胞形态，是区分不同微生物的重要标准。在YPD培养基上生长3 d后，R59菌株的菌落较湿润且不光滑，呈淡黄色到淡粉色，菌落外周有放射状突起（图1A）。在油镜下观察，该菌株的细胞体积较酿酒酵母细胞大，多数为椭圆形，部分细胞能观察到正在进行出芽生殖，也有一部分细胞连在一起形成假菌丝（图1B）。综上所述，R59菌株的菌落形态和细胞形态与短梗霉类似。

rDNA序列在真菌基因组合中成簇存在，具有较高保守性，常用于菌株的分子鉴定。在rDNA各个区域中，ITS rDNA与26S rDNA和18S rDNA区域相比具有更高的变异度，同时其保守性也足以用于进行酵母的种属区分。如图2所示，R59菌株与短梗霉属的CBS109800菌株位于进化树的同一支，说明其进化关系最为接近，两者的ITS rDNA相似度超过99%。综合形态学观察和分子生物学鉴定结果，R59菌株的种属位置鉴定为Aureobasidium melanogenum。

2.3  香气物质成分分析

利用液质联用对R59菌株发酵液中的香气成分进行了分析[16-17]，检出了11种香气成分，包括多种酯类物质（表2）。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸异戊酯3种香气成分占比最高，浓度分别为172.9、261.2和127.3 μg/mL，说明它们对R59菌株发酵液中的香气贡献较大。此外，也检测出3-甲基丁醛、乙酸乙酯、苯甲酸苯乙酯、α-紫罗酮、金合欢基丙酮、柠檬醛和乙苯等7种香气成分，浓度在6.8～ 36.1 μg/mL之间，它们可能赋予了R59菌株明显而

不同的香气特征，决定了发酵液香气的丰富性[18-19]。此外，检测到1种不利成分2-甲基丙醇，该物质有刺激性气味，对香气有不利影响。

2.4  发酵产香条件的优化

液质联用分析发现，R59菌株能产生较高浓度的苯乙醛和醋酸异戊酯，这两种物质具有典型的果香香气，并且在其他产香酵母中含量较少，是决定R59菌株产香特征的关键成分。以提高苯乙醛和醋酸异戊酯的产量为目标，研究培养基中不同的葡萄糖浓度、氮源种类、玉米浆浓度和pH对产香的影响，用HPLC测定两种物质的产量，找到最合适的发酵条件。如图3（A）所示，随着葡萄糖浓度增加至30 g/L，苯乙醛的产量也升高，葡萄糖浓度继续提升，苯乙醛产量基本保持不变;而醋酸异戊酯在葡萄糖浓度增大到20 g/L之后，产量基本保持不变。这说明苯乙醛和醋酸异戊酯的合成途径可能有差别。有机氮源玉米浆对两种物质的生产有明显的促进作用，苯乙醛和醋酸异戊酯的产量分别达到336.4和129.3 μg/mL（图3B）。如图3（C）所示，最佳的玉米浆浓度为15 g/L;如图3（D）所示，在pH 5.0的培养基中，苯乙醛和醋酸异戊酯的产量最高，pH过高和过低均影响香气物质的合成，这种趋势和酵母菌生长的pH特性相一致。因此，苯乙

醛和醋酸异戊酯最适宜的发酵条件为葡萄糖30 g/L、玉米浆15 g/L、培养基pH 5.0。在此条件下，苯乙醛和醋酸异戊酯的产量分别达到348.6和143.7 μg/mL。

2.5  菌株发酵液在烤烟增香中的应用评价

采用R59菌株的发酵液处理烟丝并进行感官评价，如表3所示，添加发酵液的卷烟样品，烟丝的协调性、香气和余味指标分值均高于对照，表现为发酵样品的果香气更浓更饱满，香气的协调性也有增加，余味更干净，抽吸品质显著提高，而当发酵液添加量超过10 μL/g时，烟丝的抽吸品质不会再有进一步提高。此外，添加发酵液会引起卷烟刺激性和杂气的加重，这可能和发酵液中香气物质之外的代谢产物有关。

3  讨  论

利用微生物开发绿色、环保的新型烟草香料，是替代化学法合成烟草香料的可行途径。微生物种类众多，产生的香气也多种多样，杜飞等[20]从茅台酒酒糟和茯砖茶中分离出的酿酒酵母和冠突散囊菌，可以产生茶香、酒香、蜜甜香及特殊的香味，以其发酵液处理烟叶，可有效提高其感官品質。郭林青等[21]从水果表面筛选到汉逊酵母菌株，可利用烟末发酵产生花香香韵和甜香香韵物质。朱克永[22]从猕猴桃表皮分离得到酵母菌株，发酵后具有优雅水果香气和猕猴桃自然果香。本研究从湖北省恩施土家族苗族自治州利川市烟草种植区的烟叶中分离了69株细菌和57株真菌，并从中筛选到5种产香微生物。其中R59菌株的产香能力最强，嗅香评分最高，因此对其进行了产香和应用研究。对R59菌株的菌落形态及细胞形态进行观察，并对该菌株的ITS rDNA序列进行分析和Blast比对，将其鉴定为Aureobasidium melanogenum。

通过对R59菌株的香气成分进行测定，检测出11种致香成分。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸异戊酯产量均超过100 μg/mL，特别是苯乙醛的产量达到261.2 μg/mL。根据化学物质的香气特征，苯乙醛具有水果的甜香气，醋酸异戊酯具有香蕉、苹果样香气，而苯乙醇具有典型的玫瑰香气，并且具有增强香气的作用，这3种组分可能是R59菌株具有较强果香且较为持久的原因。其他8种浓度较低的成分，则可能在赋予R59菌株香气的丰富度上发挥作用。而对于不利成分2-甲基丙醇，后续可以通过原生质体融合或者诱变育种技术对菌株进行改良，以减少该物质的含量，提高香气品质。

苯乙醇是产香酵母中较为常见的一种香气物质，并且对香气特征起到较大的作用[23-24]。而高产苯乙醛和醋酸异戊酯的酵母菌则较少报道，在多数产香酵母中这两种物质的含量较低。本研究对R59菌株的发酵条件进行了研究，发现葡萄糖浓度、氮源种类和溶液pH均对苯乙醛和醋酸异戊酯的产量有较大的影响，其中最适的葡萄糖浓度为30 g/L、最优氮源玉米浆浓度为15 g/L，最适pH为5.0。在该培养条件下发酵，R59菌株的苯乙醛和醋酸异戊酯的产量分别提高30%以上和10%以上。将R59菌株的发酵液喷洒至烟丝表面后进行感官质量评价，发现喷洒10 μL/g的发酵液可有效改善烟丝的协调性、香气和余味等。

R59菌株产香发酵成本低，生产迅速，不需要复杂的提取步骤，有较强的实际意义。而之前的研究中，发酵所产香气物质均需单独的有机试剂萃取过程，才能用于烟草增香[25-26]，与之相比，本研究具有明显的工艺简便性。

4  结  论

本研究筛选到具有明显产香能力的R59菌株，对其rDNA-ITS序列分析，鉴定其为Aureobasidium melanogenum。R59菌株能够分泌超过11种香气化合物，主要的香气物质为苯乙醇、苯乙醛和醋酸异戊酯，通过对其发酵的培养基组分进行优化后，进一步提升了菌株苯乙醛和醋酸异戊酯的产量。对卷烟样品评吸结果发现，添加R59菌株发酵液能够有效增加卷烟的协调性、香气和余味，且最佳添加量为10 μL/g。R59菌株的产香发酵成本低，添加工艺简单，可以作为一种提高烟草品质的香料来源。

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