15味中草药水煎剂对狐源O1型肠外致病性大肠杆菌体外抑菌效果

冯 岭 刘勃兴 赵安奇 史秋梅*

(1.乐亭县农业农村局，唐山，063000；2.河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛，066004)

在狐(Vulpes)饲养过程中，肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)是一种重要的细菌病原，ExPEC感染狐后可引起脑膜炎、尿道炎、母狐流产等，并常侵袭仔狐引发败血症导致死亡。据报道，从秦皇岛地区病死狐体内分离的ExPEC中，O1血清型占比较高，是该地区主要流行血清型之一[1]。近年来，我国山东、东北三省、河北等地区均有研究[2-4]证明，从临床分离的狐源大肠杆菌具有严重的多重耐药，给临床治疗狐源大肠杆菌病带来了严峻的挑战。在解决致病菌株对抗生素类耐药问题中，中草药作为抗生素药物的替代药已成为研究的热点。部分中草药具有抗菌、消炎、滋补等功效，并有研究证实多种中草药对多种家禽、家畜以及水产动物致病菌具有良好的抑菌效果[5-7]。

本研究以临床分离的狐源O1型肠外致病性大肠杆菌为试验菌株，检验15味中药水煎剂对试验菌株的体外抑菌效果，以期筛选出对秦皇岛地方流行性狐源大肠杆菌具有良好抑菌效果的中草药，为临床应用中草药治疗该地区狐源大肠杆菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

狐源O1型肠外致病性大肠杆菌QHEO1，分离自秦皇岛地区某毛皮动物养殖场的病死银狐(Vulpesvulpesfulva)心血，该银狐6月龄，临床剖检以严重败血症为主。分离后加甘油置于实验室超低温冰箱冻存。

1.2 主要试剂

15味中药(五味子、黄芩、石榴皮、白头翁、秦皮、五倍子、女贞子、乌梅、黄连、板蓝根、诃子、连翘、金银花、黄柏、柴胡)，购自秦皇岛唐人医药药店；伊红美蓝培养基为北京陆桥科技股份有限公司产品；体积分数2%的氯化三苯四氮唑(TTC)为北京索莱宝科技有限公司产品；96孔细菌培养板为美国Corning公司产品。

1.3 中草药水煎剂制备

称取100 g中草药，置于烧杯中，加入5—10倍中药体积的蒸馏水浸泡1 h，置于加热器上大火煮沸，后改为文火继续煎煮0.5 h，倒出水煎药液，再次加蒸馏水煎煮1次，时间为0.5 h。将2次的中药水煎剂用12层纱布过滤，离心，文火浓缩至生药浓度(1 g/mL)，分装药液后121℃高压灭菌15 min。

1.4 试验菌液制备

将QHEO1菌株接种于伊红美蓝培养基，置于37℃隔水式恒温培养箱培养12 h，挑取有金属光泽的单菌落接种至LB液体培养基，置于37℃、转速为180 r/min的恒温摇床培养12 h，以1∶100的比例再次接种于LB液体培养基，置于上述恒温摇床培养至对数期，即用全波长酶标仪检测菌液OD600约为0.6。用无菌PBS洗涤菌液后调整菌液浓度约为1×106cfu/mL后立刻进行后续试验。

1.5 测定中草药体外抑菌直径

采用琼脂打孔法测定15味中草药对QHEO1菌株的体外抑菌直径。在超净工作台中向LB固体培养基中加入100 μL制备的QHEO1菌液，晾干液体后用已灭菌的打孔器在培养基上打出直径为6 mm的圆孔，每个平板打4个孔，孔间距均匀且适中，用酒精灯封孔底。向孔中加入100 μL中草药水煎剂，对照孔加入同剂量的无菌PBS，置于上述恒温培养箱培养12 h后测定抑菌圈直径，试验重复3次，取平均值为最终结果。抑菌圈直径(D)判定标准：D≥20 mm，为极敏；15 mm≤D<20 mm，为高敏；10 mm≤D<15 mm，为中敏；0 mm≤D<10 mm，为低敏；D=0 mm，为无抑菌效果。

1.6 中草药的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定

采用改良微量二倍稀释平板法测定中草药水煎剂对QHEO1菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)测定。将96孔细菌培养板在超净台酒精灯附近无菌区打开，用移液器向第2—第11孔加入100 μL高压后的蒸馏水，继续在第2孔加入100 μL制备的中草药水煎剂，混匀，取100 μL依次倍比稀释至第9孔后弃液，向第2—第11孔内加入100 μL 2×LB液体培养基，向第2—第10孔加入10 μL菌液。第10孔为阳性对照孔(未加入中草药水煎剂)，第11孔为阴性对照孔(未加入菌液)。将细菌培养板置于培养箱培养24 h。

培养后向每孔加入5 μL体积分数2%的TTC，轻轻混匀，继续培养2 h后观察，以不显红色的孔内中草药水煎剂最高稀释倍数的浓度为MIC。

取50 μL细菌培养板中的培养物涂布于LB固体培养基，置于上述培养箱培养24 h，以无菌落生长的培养液中草药水煎剂最小浓度为MBC。

试验成立标准为，阴性对照孔不变红且无菌落长出，阳性孔变红且有菌落长出。重复试验3次。

2 结果与分析

2.1 中草药体外抑菌直径

试验结果(表1)显示：15味中草药中，石榴皮水煎剂对QHEO1菌株的抑菌圈直径最大，表现为极敏；五味子水煎剂的抑菌圈直径排名第2，表现为高敏；乌梅、诃子、五倍子、女贞子也出现抑菌圈，判定结果均为中敏。黄芩、白头翁、秦皮等9味中草药水煎剂加入的孔无抑菌圈，判定为无抑菌效果。

表1 15味中草药对狐源QHEO1的体外抑菌效果Tab.1 Results of in vitro antibacterial efficacy of 15 Chinese herbal medicines

2.2 中草药的MIC和MBC

MIC和MBC测定试验结果见表1。由表1可见，石榴皮、诃子、五味子水煎剂MIC数值最低，为15.63 mg/mL，乌梅、五倍子、女贞子水煎剂MIC为31.25—62.5 mg/mL，黄芩、白头翁、秦皮等9味中草药对试验菌株未表现出抑菌效果。石榴皮和五味子的MBC数值最低，为15.63 mg/mL，乌梅、诃子、五倍子、女贞子水煎剂MBC为31.25—125 mg/mL，黄芩、白头翁、秦皮等9味中草药对试验菌株未表现出抑菌效果。

3 结论与讨论

为研究石榴皮、五味子、乌梅等15味中草药水煎剂作为临床治疗肠外致病性大肠杆菌病可行性，对15种中草药的体外抑菌效果进行了检测。结果显示，秦皇岛狐源地方流行性大肠杆菌株QHEO1对15味中草药表现出不同程度的敏感性，中草药水煎剂抑菌效果从高到低依次为石榴皮、五味子、乌梅、五倍子、诃子、女贞子。石榴皮具有涩肠止泻、驱虫等功效，常用于久泻、久痢、便血等的治疗，据报道其对鸡、猪、水貂(Neovisonvison)等多种畜禽源致病菌(大肠杆菌Escherichiacoli、沙门菌Salmonellaspp.、绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa等)和水产动物致病菌(变形杆菌Proteus、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus)等均具有良好的抑菌效果[8-12]。因此，可将石榴皮作为狐源大肠杆菌治疗药物进一步研究：如石榴皮对不同血清型狐源致病性大肠杆菌的抑菌效果，验证石榴皮与其他中草药(如本研究中同样具有较好抑菌效果的五倍子、乌梅等)配伍组方制剂的抑菌效果，进行动物试验以及临床应用检验石榴皮对狐源大肠杆菌病的治疗效果等。

本研究中，黄芩、白头翁、秦皮等中草药水煎剂对试验菌株未表现出抑菌效果，可能与提取方法和试验菌株有关，需更换提取方法，如改用其他亲水性或亲脂性溶剂提取，或采用浸渍法、水蒸气蒸馏法等方法提取等；更换同一血清型或不同血清型狐源大肠杆菌作为试验菌株验证中草药的抑菌效果。

本研究采用水煎煮法提取了15味中草药，验证了其对秦皇岛狐源O1型肠外致病性大肠杆菌的抑菌效果，筛选出具有抑菌效果的石榴皮、五味子、乌梅、五倍子、诃子、女贞子6味中药，可为中草药水煎剂治疗狐源大肠杆菌病的提供参考。