环尾狐猴疑似不动杆菌感染的诊治

王宇翔

(福州市动物园管理处，福州，350012)

不动杆菌属(Acinetobacter)细菌隶属于变形菌门(Proteobacteria)，以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，假单胞目(Pseudomonadales)，莫拉菌科(Moraxellaceae)，非发酵菌，为条件致病菌。当动物机体抵抗力降低时易引起机体感染，它是引起动物感染的重要条件致病菌之一[1]。目前不动杆菌属至少分为21个基因种[2]。该菌可引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等[2]，重症者可导致死亡。在动物临床多见于牛、猪等家畜与犬科(Canidae)动物，圈养野生动物的病例较为少见。

环尾狐猴(Lemurcatta)是来自非洲马达加斯加岛森林中的灵长类(Primates)动物，因尾部环形斑纹与狐狸样的眼睛而得名，性情活泼好动，以树叶、瓜果等为食，圈养状态下与人亲近，在我国多数大城市动物园内都有圈养种群。环尾狐猴感染不动杆菌的病例在国内文献资料中尚未得见，过往报道中可见不动杆菌致犊牛(Bostaurus)[3]、山羊(Capraaegagrushircus)、育成兔(Leporidae)[4]肺炎，仔猪(Susscrofadomestica)腹泻[5]等病例，而国内动物园的灵长类动物亦未见到类似病例。本研究于环尾狐猴肝脏中分离鉴定出1株不动杆菌，并进一步研究了菌株的耐药情况，进行针对性的治疗后疗效确切，现将诊疗过程描述如下，冀望能为同行的野生动物疾病防控工作提供借鉴。

1 发病过程与临床治疗

2018年6月21日，发现第1只发病环尾狐猴(下文称其为1号环尾狐猴，以此类推)。该环尾狐猴表现出精神萎顿，被毛凌乱，行动迟缓，食欲变得很差，立即将其移出笼舍入兽医院治疗，测得其肛温39.6℃。因当日福州天气酷热，其症状也与中暑相似，遂按中暑进行治疗。方法是移入空调房中，酒精擦拭身体等进行物理降温，同时用头孢菌素、电解质与能量液(包括ATP、肌苷、辅酶A、肝泰乐和维生素C等)输液，治疗后其状态有所好转，体温一度降为37.5℃，然而第2天早晨该环尾狐猴死亡。

6月24日，同时发现2号、3号、4号环尾狐猴患相似症状，精神萎顿，食欲不振，呼吸不畅，有呼吸道分泌物。将3只患病环尾狐猴移入兽医院治疗。其中2号环尾狐猴呼吸困难明显，鼻腔内见脓鼻涕，肛温达43℃，未经治疗便死亡。

3号与4号环尾狐猴，兽医使用了与1号相似的疗法治疗，在输液中使用了头孢噻肟钠和阿米卡星，但效果不佳，分别于25日和26日相继死亡。兽医采集了2号、3号、4号的心脏、肝脏、脾脏、肺组织和肾脏样本分别送往南京军区福州总医院和福建省农业科学院进行病理检查和实验室检查。

5号患病环尾狐猴于29日被发现，其离群独自躲藏在草丛中不动，精神、食欲皆萎靡，较频繁咳嗽。将其收治后兽医结合之前病例的病理和实验室诊断进行了针对性的给药，抗生素更换为恩诺沙星，2 d后状态好转，5 d后恢复正常。具体发病与治疗情况见表1。

表1 发病环尾狐猴的临床治疗情况Tab.1 Clinical treatment of the infected lemurs

2 疾病诊断

2.1 病理检查

委托南京军区福州总医院进行检查的2号、3号和4号环尾狐猴的病样都出现了肺脏肿大出血，以及脾脏肿胀淤血的病变，其他的病变有肝细胞变性，心外膜出血，肾脏淤血等。将肉眼观察与光镜下比较典型的病变描述如下。

2.1.1 肉眼观察

3只环尾狐猴的肺脏都呈现不同程度的肿胀，2号环尾狐猴左侧肺叶肿胀明显，肺脏表面光滑无明显病变，挤压肺组织的切面，支气管内会有泡沫样的液体溢出(图1A)。2号环尾狐猴的肝脏外观有比较明显的黄染(图1B)，4号环尾狐猴的肝脏外观呈现黄绿色(图1C)。其他器官肉眼未见明显的病变。

2.1.2 光镜病变

2号环尾狐猴的肺脏表现出细支气管扩张，上皮变性脱落，支气管旁间质见少量淋巴细胞浸润，并见散在支气管周围出血(图2A、B)；肺泡壁毛细血管显著扩张充血，肺泡壁弥漫断裂，肺泡腔融合(图2C)，肺泡内局灶被膜下出血(图2D)。

3号与4号环尾狐猴的肺部切片亦显示出肺脏内部的出血与扩张性的病变(图2E、F)，4号环尾狐猴肺泡壁毛细血管显著扩张充血，肺泡腔内见蛋白液体渗出和肺泡内出血，表现较为明显的肺水肿状态。

4号环尾狐猴肝细胞呈现广泛坏死(图3A)，未坏死的肝细胞明显空泡变性(图3B)，中央静脉和血窦明显扩张淤血；3号环尾狐猴显示出肝索排列紊乱，肝细胞胞质疏松、空泡变性和肝细胞内外轻度淤胆(图3C、D)，中央静脉和血窦明显扩张淤血。3号环尾狐猴心脏的心肌间质明显充血水肿，有微血栓形成，心外膜下见散在出血灶，血液围绕心脏传导纤维(图3E)；3号环尾狐猴脾脏血窦明显淤血(图3F)，其中见多量巨噬细胞吞噬含铁血黄素和中性粒细胞浸润。

2.1.3 病理诊断

综合以上3只环尾狐猴的组织标本呈现出的肉眼与光镜形态，它们的主要病变有：

(1)急性肺气肿，肺水肿，支气管周围及被膜下出血。

(2)肝细胞坏死，脂肪肝。

(3)3号环尾狐猴心外膜出血性病变，以及脾脏淤血。

2.2 实验室诊断

2.2.1 细菌的分离培养

无菌将肝脏划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic Soy Agar，TSA)平板，37℃培养24 h。挑取单菌落再次划线培养，挑取纯化的单菌落接种胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)，于37℃培养20 h用于后续试验[6-7]。

2.2.2 细菌的种鉴定

由上海生工生物工程技术服务有限公司合成未知细菌的16S rRNA扩增引物，引物序列见表2，配成10 μmoL/L的浓度，分别以FD1+RD1、FD1+RP2、FD3+RD1、FD1+RP1、FD2+RP1、FD4+RD1为引物组合，预计扩增的片段大小约为1 500 bp。

表2 引物的序列Tab.2 Sequences of the primers

挑取纯培养物约5个菌落于50 μL ddH2O中，吹打混匀，沸水浴5 min，自然冷却后5 000g离心5 min，取上清作为模板。配制50.0 μL的PCR反应体系，其中25.0 μL Premix ExTaq(TakaRa公司)、上下游引物各0.5 μL、1.0 μL模板、23.0 μL ddH2O。PCR扩增的反应循环参数为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统进行观察。将PCR扩增产物和对应的引物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将序列上传至GenBank数据库进行比对。

2.2.3 药敏试验

用于试验的药物有：青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢唑啉、多粘菌素B、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、壮观霉素、新霉素、红霉素、四环素、强力霉素、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、甲砜霉素、氟苯尼考、林可霉素、克林霉素、利福平。纸片扩散法测定菌株对常用抗生素的敏感性，参考2004年美国临床实验室标准化委员会药敏试验判断标准[8]进行，质控菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922。按中国食品药品检定研究院制定的《抗菌药物药敏试验判断标准》进行判定。

2.2.4 实验室检查结果

细菌分离培养的第2天，肉眼观察到菌落较大的细菌，菌落的边缘光滑，直径约5 mm，生长速度快。针对该未知菌的6对16S rRNA引物扩增结果显示，其中1对引物的产物亮，将该PCR扩增产物和对应的引物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将序列上传至GenBank数据库进行比对，得出该菌为不动杆菌，PCR结果见图4。

经药敏试验测得该细菌敏感的药物有恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星，均为喹诺酮类。而其对头孢类和氨基糖苷类药物不敏感。

2.2.5 诊断结论

经临床症状的观察，剖检呈现的病理变化和实验室检验，结合不动杆菌引发疾病的相关文献，该批患病环尾狐猴符合不动杆菌引发的急性肺炎和肝脏炎症，并伴有心脏和脾脏的出血性病变，诊断该病为不动杆菌感染。

3 后续的治疗与预防

在诊断该次发病为不动杆菌感染，并得到药敏试验结果后，兽医首先改变了5号患病环尾狐猴的治疗方案，将抗生素改用恩诺沙星，结合地塞米松、清开灵、能量液(包括ATP、肌苷、辅酶A、肝泰乐、维生素C等)以及电解质等药物进行治疗，2 d后环尾狐猴病情得到控制，体温恢复正常，5 d后食欲恢复，又观察1周后放归群体。

兽医还使用了该菌较为敏感的药物诺氟沙星给予全群的环尾狐猴进行了连续5 d预防性的投喂，并对笼舍进行了彻底的消毒，给环尾狐猴笼舍内又增加了遮阳板、电扇等防暑设施，也在环尾狐猴的饮水中加入了夏桑菊颗粒等解暑的药物，增加饲料中西瓜、黄瓜等水分较高的食物的比例，至今未再出现相似的病例。

4 讨论

不动杆菌属细菌是典型的条件致病菌，广泛分布于外界环境中，主要在水体和土壤中，易在潮湿环境中生存。该菌黏附力极强，易在水槽等设施上黏附储存，当动物生存环境出现恶化，机体抵抗力突然降低时易引起机体感染，是引起动物感染的重要机会致病菌之一。本菌可引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等[8]。重症者可导致死亡。感染源可以是病畜自身(内源性感染)，亦可以是不动杆菌感染者或带菌者。传播途径有接触传播和空气传播。

福州动物园的环尾狐猴笼舍位于动物园北区的山林间，占地面积约1 500 m2，笼舍分为大运动场、室内活动场及玻璃参观房3个区。运动场地面为自然土地，分布5间保暖房供其自由出入。室内及玻璃房为水泥地面。日常饲喂的食物主要有水果(苹果、梨、橙、橘等)、时令蔬菜、面包、自制营养窝头、红枣等。该笼舍共饲育有18只环尾狐猴(6♂12♀)。其中大群饲养12只，部分打架群体单独关在隔离房，饲养情况稳定，定期消毒、查虫和驱虫。本次环尾狐猴发病的可能原因：一是与本地夏季持续高温(日间气温高达40℃左右)，引起动物体况下降，引发该菌致病有关，环尾狐猴的笼舍在发病前缺乏遮挡物，而该物种并非耐热品种；二是环尾狐猴和人类的互动较为频繁，有可能经由与人类的接触而携带该病原。福州动物园工作人员之后进行了针对性的笼舍完善，加强了饲养管理，并减少了游客与动物的直接接触，至今为止未在出现类似病例。

不动杆菌属是一类有较强的生存能力及产生和传播其耐药性能力的细菌，不动杆菌的耐药机制复杂多样，其中可能的耐药机制包括天然耐药或获得性耐药，包括产生内酰胺酶，外排泵机制，外膜通透性的降低，特殊抗生素位点的突变如氟喹诺酮药物和产生可以钝化氨基糖苷类药物的多种酶[9-11]。临床上大量使用的广谱抗生素也为该菌的耐药性创造了有利的环境[12]，尤其是该属中的鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)几乎对所有临床使用的抗菌药物(β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、碳青霉烯类)耐药[13]，甚至出现了多重耐药菌株[14]，国内已经见过大量关于不动杆菌耐药的报道[15-17]。

福州市动物园发现的这例感染中，兽医一开始使用了多种广谱抗生素进行尝试性的治疗，并未取得好的疗效，而药敏试验的结果表明，该菌敏感的药物是恩诺沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物，而对头孢类和氨基糖苷类皆不敏感。之后针对性给药后疗效确切。

本次环尾狐猴疑似不动杆菌感染的病例对野生动物的诊疗有一定参考作用。提醒在未来用药的过程中要合理使用抗生素，尽量结合药敏试验针对性地给药，注意联合用药，最大程度地减少耐药菌株的出现。也要做好对常见的条件致病菌的预防，在天气环境恶劣或者突变时加强管理，必要时预防性给药；在日常饲养中注重改善兽舍环境，进行彻底的消毒，并注意动物营养的补充，提高动物自身免疫力。