中国产托京褐扁颅蝠分类地位的探讨

梁晓玲 李彦男 谢慧娴 张惠光 詹丽英 吴 毅 周 全* 余文华*

(1.广州大学生命科学学院，广州，510006；2.武夷山国家公园科研监测中心，南平，353000)

翼手目(Chiroptera)俗称蝙蝠，是唯一具飞行能力的夜行性哺乳动物，该类群在我国有8科140多种[1]，其中福建省已记录的翼手目种类数量为6科46种[2]。武夷山位于福建北部，属典型的中亚热带湿润季风性气候[3]，为生物学多样性热点区域，已记录具有较高的翼手目物种多样性[4]。其中扁颅蝠属(Tylonycteris，也称“竹蝠”)为翼手类中极为特化的类群，在具狭缝的竹节洞内栖息，特化出脑颅扁平、体型小且第1指基部具肉垫的特征[5]。虽然武夷山具有丰富的竹类资源[3]，但该地区至今未见扁颅蝠分布的相关报道。

2004年前传统蝙蝠分类学者认为扁颅蝠属全世界仅2种，即：扁颅蝠(T.pachypus)，体型较小，体重常为3—4 g，毛色偏向棕黄色、茶褐色；褐扁颅蝠(T.robustula)，体型较大，体重通常大于4 g，毛色偏向暗褐色[5-6]。两者的分布区均从中国南部一直延伸至东南亚各岛屿[7-8]。随着野外调查强度的加大、标本的积累及分子系统学研究的开展，该属分类体系不断完善。Feng等[9]根据云南西双版纳标本，描述了1种体型更小的“竹蝠”形态特征：体重约3 g，前臂长23.90—25.61 mm，颅全长7.64—8.50 mm，命名为小扁颅蝠(T.pygmaea)。其后，Huang等[10]通过核型分析、形态学、系统发育和种群遗传结构分析等方法，将中国区域的扁颅蝠华南亚种(T.pachypusfulvida)提升为种，即华南扁颅蝠(T.fulvida)。最近Tu等[11]基于形态学、系统发育学、生物地理学等证据，进一步揭示扁颅蝠属中存在多个隐种，分布于苏门答腊岛的褐扁颅蝠保留原种名不变，将分布在马来西亚半岛、中南半岛南部和印度北部的原褐扁颅蝠马来亚亚种提升为种——马来褐扁颅蝠(T.malayana)，将分布于中南半岛北部的“褐扁颅蝠”新命名为托京褐扁颅蝠(T.tonkinensis)，并提出在中国分布的“褐扁颅蝠”有待进一步核实。综上所述，目前扁颅蝠属实含6个有效种，分别为小扁颅蝠、扁颅蝠、华南扁颅蝠、褐扁颅蝠、马来褐扁颅蝠、托京褐扁颅蝠[12]。

物种分类订正对区域内本底状况的明确、生态保护统筹规划及后续生物学研究准确开展尤为重要。为进一步厘定“褐扁颅蝠”物种，明确其国内分布种类及种群历史动态，对馆藏于广州大学华南生物多样性保护与利用重点实验室的“褐扁颅蝠”标本进行形态学、分子系统发育学及种群遗传学初步分析。同时，对2020年6月在福建武夷山采集的2只“竹蝠”进行了外部形态、头骨特征及分子系统发育学分析，将其鉴定为托京褐扁颅蝠，为福建省翼手目分布的新纪录。

1 材料与方法

1.1 标本采集

于2020年6月8—19日在福建省武夷山妙莲古寺半山步道(27°41′16″N，117°56′4″E，海拔266 m)和止止庵东入口林道竹林附近(27°38′39″N，117°57′40″E，海拔210 m)，使用蝙蝠竖琴网采集到2只小型蝙蝠(标本号：GZHU 20048，♂；GZHU 20050，♀)，上述标本现保存在广州大学华南生物多样性保护与利用重点实验室。同时，分析使用了历年采集的“褐扁颅蝠”材料(合计形态标本75号、分子样品21号)，采集地覆盖福建、江西、海南、广东、广西、贵州、云南、四川等省份。

1.2 外形及头骨测量

使用数显式电子天平(MH-Series Pocket Scale，昆明诺金科技有限公司，精度0.1 g)称量标本的体重(body mass，MASS)。参照哺乳动物测量标准[13]，用数显游标卡尺(MNT-150，上海美耐特实业有限公司，精度0.01 mm)对其外形及头骨指标进行测量，外形指标包括，前臂长(forearm length，FA)、头体长(head and body length，HB)、尾长(tail length，T)、耳长(ear length，E)、胫骨长(tibia length，Tib)及后足长(hindfoot length，HF)；头骨测量指标包括，颅全长(greatest length of skull，GTL)、枕犬长(condylo-canine length，CCL)、颧宽(zygomatic width，ZW)、脑颅宽(breadth of braincase，BB)、眶间宽(interorbital of width，IOW)、腭桥长(palatal bridge length，PL)、上齿列长(maxillary tooth row length，C1-M3)、上犬齿间宽(upper canine width，C1-C1)、上第3臼齿间宽(upper third molar width，M3-M3)、下齿列长(mandibular tooth row length，C1-M3)、下颌长(mandibular length，ML)。

1.3 COⅠ和Cyt b基因目的片段的扩增

取标本的肌肉或肝脏组织，使用DNA试剂盒(AG通用型基因组AG21009，艾科瑞生物)提取其总DNA。然后应用引物[14]COⅠ-F：5′-TTC TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GG-3′和COⅠ-R：5′-TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA-3′；Cytb-F：5′-CCC TTY TCT GGT TTA CAA GAC C-3′和Cytb-R：5′-AAY CAC CGT TGT AYT TCA ACT A-3′，扩增COⅠ和Cytb基因的部分序列。COⅠ的PCR反应总体系50 μL，其中PremixTaqTM25 μL，引物1 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 20 μL；程序为，94℃预变性3 min；94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸90 s，37个循环；最终72℃延伸5 min。Cytb的PCR反应总体系30 μL，PremixTaqTM15 μL，引物1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 9 μL；程序为，94℃预变性5 min；94℃变性45 s，46℃退火45 s，72℃延伸60 s，37个循环；最终72℃延伸10 min。

1.4 系统发育学分析

测序结果使用Geneious v5.6[15]进行人工拼接与校对。将拼接好的序列与从NCBI-nt数据库中下载的已有扁颅蝠属物种的部分序列进行排序比对(序列号见附录1和附录2)。ModelFinder[16]明确最佳核苷酸替换模型为HKY+F+G4(COⅠ)和TPM2+F+G4(Cytb)，IQ-TREE[17]构建极似然树，自展(bootstrap)1 000次估计节点支持度。MrModeltest v2[18]明确最佳核苷酸替换模型，COⅠ和Cytb均为GTR+G，MrBayes 3.2[19]构建贝叶斯树，总抽样代数为10 000 000，抽样频率为1 000，丢弃前25%数据。2种方法均将圆耳管鼻蝠(Murinacyclotis)设置为外群。

附录1 用于扁颅蝠属系统发育树构建的COⅠ序列号Appendix 1 COⅠ sequence numbers included in phylogenetic reconstructions

附录2 用于扁颅蝠系统发育树构建的Cyt b序列号Appendix 2 Cyt b sequence numbers included in phylogenetic reconstructions

1.5 种群遗传结构及历史动态分析

用于种群遗传结构及历史动态分析的托京褐扁颅蝠COⅠ和Cytb序列分别为30、21个。国内种群包括四川、云南、贵州、广西、广东、海南、江西、福建，国外种群包括越南、老挝。DnaSP 6[20]计算托京褐扁颅蝠种群序列遗传多样性指数。PopArt 1.7[21]构建TCS单倍型网络图。Arlequin v3.5[22]进行分子变异分析(AMOVA)，估算遗传分化指数(F-statistics，Fst)，排列测验法(Permutation test)检验Fst的显著性，重复次数为1 000。

由于现有的托京褐扁颅蝠序列并未体现明显种群遗传结构，故将各种群予以合并。通常，Fu’sFs检测呈现显著负值并且错配分布图呈泊松分布的单峰型，说明种群趋于发生种群扩张[23]。DnaSP 6[20]中进行Tajima’sD检验和Fu’sFs检验，判断该群体的进化是否符合中性进化假说[24]，错配分布检验进一步验证是否经历历史扩张。BEAST 2[25]绘制贝叶斯天际线，COⅠ基因核苷酸替换率[11]设置为(0.015±0.005)subst/site/Myr(每百万年突变1%—2%)和(0.020±0.005)subst/site/Myr(每百万年突变1.5%—2.5%)，Cytb基因核苷酸突变率设置为(0.020±0.005)subst/site/Myr(每百万年突变1.5%—2.5%)和(0.025±0.005)subst/site/Myr(每百万年突变2%—3%)，上述分析均使用HKY核苷酸替换模型和严格分子钟模式(Strict Clock，rate：1.0)，运行1 000万代MCMC，每1 000代进行一次抽样。Tracer 2[26]汇总抽样数据和绘制天际线图。

2 结果

2.1 外形特征

研究标本为小型蝙蝠种类，前臂长为24.76—29.59 mm，与描述的托京褐扁颅蝠新种25.10—27.80 mm及马来褐扁颅蝠25.50—27.50 mm相重叠，三者外形难以区分(表1)，其中福建2个标本(GZHU 20048，♂；GZHU 20050，♀)前臂长分别为28.41、27.16 mm。这些标本鼻吻部较短；耳短小，呈三角形，尖端宽且圆，耳屏短钝；头部和背部毛发呈棕褐色，面部和耳呈黑褐色，颈部和腹部毛色较浅，呈淡褐色；第1指基部和足部均具有明显的肉质垫，拇指的肉垫近椭圆形且较小，后肢的肉垫呈掌形，第3掌骨和第4掌骨长度较为接近，第5掌骨较短(福建标本，图1)。这些特征均与Tu等[11]描述的托京褐扁颅蝠相吻合。

2.2 头骨特征

标本颅全长10.64—12.55 mm，其头骨度量学指标与托京褐扁颅蝠及马来褐扁颅蝠均相近。以福建标本为例(图1)，其头骨特征如下：头骨小，颅全长为10.64—11.99 mm，极扁平且宽；眼眶前缘具尖端突起；矢状嵴不发达，人字嵴较为明显。颧弓发达，颧宽7.42—10.51 mm。齿式为2.1.1.3/3.1.2.3=32。第1上门齿(I1)明显低于第2上门齿(I2)，后者为双尖形；第1上臼齿(M1)和第2上臼齿(M2)均具有发达的中附尖，咬合面呈“W”型，第3上臼齿(M3)有退化迹象。下犬齿(C1)高度是第1下前臼齿(Pm2)的2倍，第1下臼齿(M1)前尖低于后尖，第2下臼齿(M2)、第3下臼齿(M3)前尖均高于后尖。

2.3 种群遗传结构

托京褐扁颅蝠的COⅠ序列检测到24个变异位点，其中单一信息位点有18个，简约信息位点为6个，定义出16种单倍型，单倍型多样性为0.862，核苷酸多样性为0.004，其中Tt_H9、Tt_H13、Tt_H16为优势单倍型，分布最为广泛，为2个群体所共享，占个体数53.33%(16/30)(图2C、D)。Cytb分子标记检测到41个变异位点，单一信息位点有28个，简约信息位点为13个，可定义18个单倍型，单倍型多样性为0.986，核苷酸多样性为0.006，缺少共享单倍型。

依据619 bp的COⅠ序列构建的系统发育树显示，这些标本与从NCBI-nt数据库中下载的已有扁颅蝠属物种中的托京褐扁颅蝠[11]聚为高支持度的一支(贝叶斯法的后验概率为1.0，最大似然法支持度为98)，支持将该批标本鉴定为托京褐扁颅蝠而非马来褐扁颅蝠或褐扁颅蝠(图2A)。而基于1 105 bp的Cytb序列系统发育树结果同样支持该批标本为托京褐扁颅蝠(图2B，贝叶斯法的后验概率为1.0，最大似然法支持度为100)。在支系内关系中，2种分子标记的结果均提示国内外的托京褐扁颅蝠似乎源于一个大的混杂种群，无明显种群遗传结构。该结果也与单倍型网络图结果相吻合(图2C、D)，COⅠ基因的TCS网络图整体呈星状，单倍型Tt_H9为中心单倍型；基于Cytb基因TCS网络图整体呈现双星状，缺少共享单倍型。2种分子标记的AMOVA分析显示：遗传变异主要来源于种群内，分别占遗传变异的99.46%(COⅠ)和99.36%(Cytb)，高于种群间变异(表4)。种群间的遗传分化指数(Fst)均为0.01(P>0.01)，表明群体间未存在显著性遗传差异(表4)。这些结果均提示现有的分子标记显示国内外的托京褐扁颅蝠似乎源于一大的混合有效种群，无明显种群遗传结构。

表3 托京褐扁颅蝠的遗传多样性参数Tab.3 Genetic diversity parameters of Tylonycteris tonkinensis

表4 基于COⅠ和Cyt b基因的分子方差分析Tab.4 Analysis of molecular variance(AMOVA)based on COⅠ and Cyt b gene segments

2.4 群体历史动态

由表3可见，基于COⅠ的托京褐扁颅蝠种群整体Fu’sFs为显著负值(P<0.05)，基于COⅠ和Cytb种群整体Tajima’sD为显著负值(P<0.01；P<0.05)，且核苷酸错配分布图呈现或近似单峰型，表明有种群扩张的历史，与贝叶斯天际线的结果基本吻合。不同的核苷酸替换速率设置下其扩张的时间并不一致(图3)，基于COⅠ的贝叶斯天际线显示，2—4百万年前种群有微小的扩张趋势，而基于Cytb的贝叶斯天际线显示2—3百万年前该种群有扩张历史。

3 讨论

Tu等[11]基于系统发育学、系统地理学，结合生物地理史和古气候竹林变迁状况进行分析提出，由于褐扁颅蝠祖先对竹林生存的依赖性，故更新世时期冰川往复消融导致竹林区域变迁，促进了该类群进一步种化进程，最终形成现阶段的3个独立种，即褐扁颅蝠(苏门答腊岛)、马来褐扁颅蝠(东南亚大陆南部和西部)、托京褐扁颅蝠(中南半岛北部)，同时冰期的反复消融也可能是地理种群不断融合扩散的成因，故本研究中托京褐扁颅蝠未见明显的种群遗传结构(图2)。根据Tu等[11]研究，托京褐扁颅蝠分布在老挝东北部、越南北部，但中国是否分布尚存疑。本研究通过对本课题组馆藏标本展开重新分类厘定，结果提示其前臂长、颅全长等形态特征与托京褐扁颅蝠(模式标本)、马来褐扁颅蝠和褐扁颅蝠(苏门答腊岛)重叠，三者在外形上难以区分(表1)，提示分子鉴定是现阶段对上述3种进行分类的可行手段。同时本研究取样尽量覆盖了“褐扁颅蝠”在中国的历史分布省份，分子系统学结果支持我国上述省份来源标本均为托京褐扁颅蝠，而非马来褐扁颅蝠或褐扁颅蝠，且前2种之间为姐妹群关系(图2)。

在缺乏分子序列数据以前，国内扁颅蝠属物种鉴定根据形态及毛色进行判别[6，27-29]，而“褐扁颅蝠”复合种中分类厘定的滞后、外部形态和头骨特征的相似，及模式标本或地模标本数据缺乏，常常导致物种鉴定误判。基因序列数据为物种鉴定另辟新径，但三者的真实分布界限，是否存在杂交区，种化的历程与机制仍有待进一步研究。而亲缘地理学结果提示，中国与越南、老挝的托京褐扁颅蝠单倍型混杂，种群间无显著性遗传差异，也进一步确证了国内“褐扁颅蝠”实为托京褐扁颅蝠。

综上所述，我国扁颅蝠属现包括小扁颅蝠、华南扁颅蝠和托京褐扁颅蝠3种。托京褐扁颅蝠(原褐扁颅蝠)在中国最早的记录出现在云南和广西[30]，随后在海南、贵州、四川、江西、广东等地被发现[6，27-29，31-32]。对于国内扁颅蝠属的物种鉴定，托京褐扁颅蝠与国内的小扁颅蝠和华南扁颅蝠2个物种在形态上区别明显，前者体重相对较大(4—5 g)，前臂较长(26—28 mm)，毛色偏暗为深褐色；华南扁颅蝠形态大小居中，毛色大体为金黄色；小扁颅蝠最小，毛色为暗棕色[1，9]。为方便后续分类鉴定工作，编制了扁颅蝠属形态特征检索表(附录3)。

附录3 国内扁颅蝠属物种检索表Appendix 3 A key to species of the genus Tylonycteris in China

从中国、越南和老挝托京褐扁颅蝠种群的历史动态研究结果可知，该种群存在种群扩张历史，随后有效种群数量保持稳定状态。这可能源于上新世(5.3—2.6百万年前)气候温暖及更新世(2.60—0.01百万年前)虽存在冰川期和间冰期往复[11]，但东南亚仍是竹林丰富的区域之一，可作为托京褐扁颅蝠的良好避难所，故有效种群保持较为稳定扩张状态(图3)。迄今，国内托京褐扁颅蝠在华南地区分布广泛，本次在福建武夷山发现托京褐扁颅蝠的分布，丰富了福建武夷山的哺乳动物物种多样性，也使该种在华南地区自四川到福建形成连续分布区。四川[6]、海南[27，33]分别为目前该种国内的最北、最南分布界限，而湖南、重庆是否存在分布有待进一步研究。

通过本底调查的持续加强及国家对相关研究工作的重视，近年我国的翼手目研究取得长足的发展，现记录合计有8科140多种[1]，但其本底信息仍未明确，更妄论其种群动态、年度及季节规律等。其中福建省一直是生物多样性热点区域，吸引众多国内外专家学者前往调查研究，翼手目物种达6科46种[2]，但通过调查工具的更新及资源调查的补充仍有新纪录种被发现[34]。该发现提示本底调查是一项需长期持续的工作，需国家政府层面予以长期性支持，尤其对分类疑难众多的小型脊椎动物类群而言。

基于分子序列已是解决疑难种或复合群物种鉴定的重要手段，但必须警惕数据中物种鉴定存误的序列信息，此外，中国分布序列信息较少也制约相关的研究工作的开展。本研究中NCBI序列号为MN366287的标本原鉴定为褐扁颅蝠，然而基于Cytb序列构建的系统发育树显示，该标本序列与托京褐扁颅蝠聚为高支持度的一支(1/100)，故实为托京褐扁颅蝠，序列KX467593的标本原鉴定为扁颅蝠实为华南扁颅蝠。故在分子鉴定上必须对序列来源及物种鉴定信息予以勘别，且作者需附录备注所使用的序列信息。

致谢：在野外调查及试验期间，得到广州大学硕士研究生张翰博、李潮韦和本科生张欣、钟韦凌的帮助，在此致以诚挚的谢意。