腺苷2B受体激动剂对大鼠高原肺水肿的治疗作用

罗芩 何庆

(1.西南交通大学医学院，四川 成都 610031； 2.西南交通大学附属医院 成都市第三人民医院，四川 成都 610031)

急性高原病是指人在进入海拔2 500 m以上的高原环境不能很快适应而发生的一系列不适症状，包括急性高山病、高原肺水肿(high-altitude pulmonary edema，HAPE)和高原脑水肿[1]。HAPE往往起病急，病情变化快，救治难度大，严重威胁人的生命健康，因此对HAPE立即进行有效治疗十分重要。

腺苷可刺激肺泡离子转运，调节肺泡内液体清除[2]。它有四种不同的G蛋白偶联腺苷受体(Ars)，包括A1AR、A2AAR、A2BAR和A3AR，其中，A2BAR高表达于Ⅱ型肺泡上皮细胞[3]。BAY60-6583是A2BAR的选择性激动剂，对其亲和力远高于其他腺苷受体[4]。有研究证明BAY60-6583在内毒素诱导的大鼠急性肺损伤模型中能抑制肺水肿、减轻肺部炎症[5]。因此，本研究旨在探究BAY60-6583是否能对急性HAPE大鼠模型起到治疗作用。

1 材料

1.1 实验仪器与试剂

高原性疾病环境模拟舱(成都达硕)，Epoch酶标检测仪(BioTeK)，荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(Bio-rad)，BAY60-6583(Master of Small Molecules)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(优尔生)，白介素(IL)-6试剂盒(优尔生)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成)，环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒(江莱)，兔抗氨酰敏感Na+通道α亚基(epithelial sodium channel-α，ENaC-α)抗体(Stressmarq)。

1.2 实验动物

清洁级SD雄性大鼠(180～220 g)[购自成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(川)2020030]。

2 方法

2.1 HAPE模型制备

将24只大鼠随机分为平原对照组(Control组)、HAPE模型组(HAPE组)和BAY60-6583干预组(BAY组)，每组8只。将HAPE组和BAY组大鼠放入高原性疾病环境模拟舱内，以10 m/s的速度升至模拟海拔6 000 m，维持48 h；Control组大鼠常氧饲养48 h。出舱后BAY组腹腔注射BAY60-6583[2 mg/(kg·d)]，Control组和HAPE组腹腔注射等体积溶媒，持续3 d。

2.2 肺含水量测定

各组动物用10%水合氯醛(0.3 mL/200 g)麻醉后，剖开胸腔，取出双侧肺叶，小心剔除肺外组织，分离左肺上叶，用电子天平称肺湿重后，置于80 ℃恒温干燥箱48 h烘干至恒重，称肺干重。计算肺含水量[肺含水量=(肺湿重-肺干重)/肺湿重]。其余的肺叶一部分用于病理观察，一部分-80 ℃冷冻保存备用。

2.3 肺组织病理观察

分离右肺上叶，用4%多聚甲醛固定，常规脱水、包埋，制成片厚约4 μm的HE染色切片，于光镜下观察肺组织病理学变化。

2.4 血清和肺组织中TNF-α和IL-6含量测定

在解剖大鼠前采集血液3～5 mL，室温自然凝固后离心10 min(3 500 r/min)，收集血清。将冻存的右肺下叶室温冰浴下解冻后称取适量肺组织，制成10%匀浆液，低温离心机3 500 r/min离心15 min，收集上清液。按所选TNF-α和IL-6试剂盒说明书测定血清和肺组织中TNF-α和IL-6的含量。

2.5 肺组织和心脏组织中SOD活性和MDA含量测定

将肺组织和心脏组织分别制成组织匀浆，收集上清液。按照所选SOD和MDA试剂盒说明书测定肺组织和心脏组织中SOD活性和MDA含量。

2.6 肺组织中cAMP水平测定

将肺组织和制成组织匀浆，收集上清液。按所选cAMP试剂盒说明书测定肺组织中cAMP水平。

2.7 反转录聚合酶链反应检测ENaC-α基因相对表达量

将冻存的肺组织制成组织匀浆，用RNA提取液提取肺组织中的总RNA，纯化后定量RNA浓度。用表1所示的引物进行扩增，荧光定量PCR仪检测ENaC-α和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA，用GAPDH mRNA表达情况归一化数据，并以相对于对照组的倍数变化情况来表示ENaC-α的mRNA相对表达量。

表1 ENaC-α和GAPDH的引物序列

2.8 蛋白质印迹法检测ENaC-α蛋白相对含量

将冻存的肺组织制成组织匀浆，提取蛋白质，并用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。电泳后进行转膜，然后用5%脱脂奶粉封闭30 min，将封闭好的聚偏二氟乙烯膜与兔抗ENaC-α多克隆抗体(1∶1 000稀释)孵育，4 ℃下过夜；然后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀释)在室温下反应30 min。用底物化学发光法检测标记的条带，并通过凝胶成像系统进行可视化，用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠肺含水量

如表2所示。与Control组相比，HAPE组大鼠肺含水量明显增多(P=0.012)；与HAPE组相比，BAY组大鼠的肺含水量明显降低(P=0.006)；差异均有统计学意义。

表2 肺含水量

3.2 肺组织HE染色

如图1所示，Control组(图1A)大鼠肺泡腔内无分泌物，肺泡壁完整，壁薄，无充血、水肿、炎性细胞浸润及红细胞渗出。HAPE组(图1B)大鼠肺泡腔内可见渗出物及大量炎症细胞、红细胞渗出，部分肺间隔增厚；支气管上皮杂乱，支气管腔狭窄、变形，大量炎性细胞聚集。与HAPE组相比，BAY组(图1C)肺组织炎性细胞浸润渗出明显减轻，肺泡腔内未见明显水肿、渗出、出血，肺泡结构完整；支气管结构较完整，有少许炎性细胞浸润。

图1 肺组织HE染色(400倍)注：A：Control组；B：HAPE组；C：BAY组。

3.3 炎症因子TNF-α和IL-6水平

如图2和图3所示，与Control组相比，HAPE组大鼠血清中TNF-α(P=0.004)及IL-6(P=0.02)水平升高，肺组织中TNF-α(P=0.012)及IL-6(P=0.032)水平升高；与HAPE组相比，BAY组大鼠血清中TNF-α(P=0.022)及IL-6(P=0.024)水平显著降低，肺组织中TNF-α(P=0.012)及IL-6(P=0.048)水平显著降低；差异均有统计学意义。

图2 血清中TNF-α及IL-6水平检测结果注：与Control组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与HAPE组相比，#表示P<0.05。

图3 肺组织中TNF-α及IL-6水平检测结果注：与Control组相比，*表示P<0.05；与HAPE组相比，#表示P<0.05。

3.4 氧化应激指标SOD活性和MDA含量

如图4和图5所示，与Control组相比，HAPE组大鼠肺组织中SOD活性降低(P=0.012)，MDA含量升高(P=0.002)，心脏组织中SOD活性降低(P=0.026)，MDA含量升高(P=0.025)；与HAPE组相比，BAY组大鼠肺组织中SOD活性升高(P=0.002)，MDA含量降低(P=0.032)，心脏组织中SOD活性升高(P=0.016)，MDA含量降低(P=0.011)；差异均有统计学意义。

图4 肺组织中SOD活性及MDA含量检测结果注：与Control组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与HAPE组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

图5 心脏组织中SOD活力及MDA含量检测结果注：与Control组相比，*表示P<0.05；与HAPE组相比，#表示P<0.05。

3.5 肺组织中cAMP水平

如图6所示，与Control组相比，HAPE组大鼠肺组织中cAMP水平较低，但差异没有统计学意义(P=0.264)；与HAPE组相比，BAY组大鼠肺组织中cAMP水平显著升高，差异有统计学意义(P=0.026)。

3.6 肺组织中ENaC-α mRNA相对表达量

如图7所示，与Control组相比，HAPE组大鼠肺组织ENaC-α mRNA相对表达量降低(P=0.042)；与HAPE组相比，BAY组大鼠肺组织ENaC-α mRNA相对表达量升高(P=0.033)；差异均有统计学意义。

图7 肺组织中ENaC-α基因相对表达量注：与Control组相比，*表示P<0.05；与HAPE组相比，#表示P<0.05。

3.7 肺组织中ENaC-α蛋白表达量

如图8所示，与Control组相比，HAPE组大鼠肺组织ENaC-α的蛋白含量降低(P=0.045)；与HAPE组相比，BAY组大鼠肺组织ENaC-α蛋白含量升高(P=0.032)；差异均有统计学意义。

图8 肺组织中ENaC-α蛋白含量注：与Control组相比，*表示P<0.05；与HAPE组相比，#表示P<0.05。

4 讨论

本研究首次证明了A2BAR激动剂BAY60-6583能减轻HAPE大鼠模型的炎症反应和氧化应激情况，能增加肺组织中的ENaC-α含量从而增加肺泡液的清除，减轻肺水肿。

有研究发现HAPE患者体内炎症相关转录mRNA增多，这些mRNA通过调节缝隙连接的表达和内皮的激活，形成了内皮通透性和液体渗漏的正前馈环；研究还发现HAPE患者体内TNF-α和IL-6含量增加，增加了肺血气屏障的通透性[6]。虽然炎症并不是HAPE形成的原因，但由缺氧诱导的肺血管内皮细胞破裂、内源性损伤物质和活性氧的释放均可触发炎症反应，而炎症反应又会反过来加重HAPE的肺损伤。而A2BAR在急性肺损伤中具有抗炎作用，可减弱肺中性粒细胞的聚集和肺内细胞因子水平，维持内皮屏障，从而减少白蛋白渗漏，提高生存率[7-9]。在本研究中，HAPE组大鼠血清和肺组织中炎症因子(TNF-α和IL-6)含量均明显高于Control组，而BAY组大鼠血清和肺组织中炎症因子水平明显低于HAPE组，说明BAY60-6583可减轻HAPE大鼠的炎症反应。

HAPE的发生与高原急性缺氧所致的氧化应激作用有着密切的关系。高原缺氧能使机体产生过量的氧自由基，使脂质过氧化作用明显增强，导致细胞的结构和功能紊乱。SOD活性和MDA含量均可反映机体的氧化应激程度，SOD活性越低、MDA含量越高，说明机体受到氧自由基攻击越多，氧化应激程度越高。肺脏作为直接感知氧浓度变化的器官，对氧化应激较为敏感[10]。在本研究中，与Control组相比，HAPE组大鼠肺组织和心脏组织中SOD活性明显降低，MDA含量明显升高；而与HAPE组相比，BAY组大鼠心肺组织的SOD活性明显升高，MDA含量明显降低。说明BAY60-6583能通过刺激A2BAR来减轻HAPE大鼠的氧化应激。

肺泡液清除是肺泡上皮，特别是Ⅱ型肺泡上皮的主要功能。在Ⅱ型肺泡上皮细胞上有许多通道参与肺泡液清除，包括顶端的ENaC、基底侧的Na+-K+-ATP酶和水通道蛋白等[11-12]。经ENaC的Na+转运是Ⅱ型肺泡上皮Na+和液体运输的主要驱动和限速步骤[12-15]。肺ENaC可受到多种因子的调节，许多药物均能刺激cAMP产生进而通过蛋白激酶A途径和交换被cAMP信号直接激活的蛋白来增强肺泡液清除[16-17]。A2BAR能与Gs蛋白相互作用激活触发腺苷酸环化酶使cAMP升高[18]。由于A2BAR在肺泡上皮细胞高表达，而cAMP是Na+通过肺泡上皮转运的关键调节因子，本研究假设肺泡上皮A2BAR有助于肺泡液平衡，从而可治疗HAPE。

ENaC由三个亚基构成，分别为α、β、γ亚基，在Ⅱ型肺泡上皮中，表达量最多且承担最多离子转运功能的是ENaC-α，远高于其他两个亚基。本研究使用了A2BAR激动剂BAY60-6583来研究其通过cAMP对ENaC-α和肺含水量的影响，进而研究其对HAPE大鼠肺水肿的清除能力。实验结果显示，与Control组相比，HAPE组大鼠肺组织中cAMP含量降低，ENaC-α的mRNA相对表达量和蛋白含量均明显降低，肺含水量明显升高；而与HAPE组相比，BAY组大鼠肺组织中cAMP含量明显升高，ENaC-α的mRNA相对表达量和蛋白含量均明显升高，肺含水量明显降低。这一实验结果说明BAY60-6583能通过激活A2BAR来增加cAMP的含量，进而增加ENaC-α的mRNA和蛋白含量，从而减少肺组织含水量，清除肺水肿，对HAPE大鼠起到治疗作用。

除肺泡上皮外，其他细胞上的A2BAR对缺氧也有保护作用。在高原环境下，红细胞上的A2BAR被激活，诱导产生2，3-双磷酸甘油酸并触发释放O2，以防止组织缺氧和肺血管渗漏[19]。另一研究表明，CD73依赖的血浆腺苷信号升高可通过A2BAR来调节红细胞的平衡核苷转运体，增强缺氧反应以更快地适应海拔升高[20]。这说明A2BAR除了可治疗高原低压低氧引起的肺水肿外，还能通过其他的机制加快机体的高原适应，在预防高原性疾病(如急性高山病、HAPE和高原脑水肿)方面可能也有很大的潜力。

综上所述，本研究提示BAY60-6583可通过激活A2BAR减少HAPE的炎症反应和氧化应激，增加肺组织内cAMP含量进而上调肺组织中ENaC-α的表达，促进肺泡液的清除，从而治疗HAPE。但除了能治疗HAPE外，A2BAR还能增强缺氧反应以使机体更快适应升高的海拔，或可能预防高原性疾病。鉴于目前能预防和治疗高原性疾病的药物并不多，A2BAR在这两方面的潜在价值值得深入研究。