NSCLC癌组织中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况与淋巴结转移和预后的相关性

冯海玲，范长玲，潘中军，何圣科，张 敏

海南省儋州市人民医院：1.病理科；2.检验科,海南儋州 571700

非小细胞肺癌(NSCLC)是临床较为常见的恶性肿瘤之一，流行病学调查显示，NSCLC约占肺癌总数的80%[1]。NSCLC发病早期均无明显的症状，大多数患者发病时已为晚期，丧失了手术治疗的绝佳时机[2]。所以，在临床治疗中，通过对患者临床标志物的分析进行临床辅助诊断已经成为目前研究的热点。双肾上腺素样激酶 1(DCLK1)是神经元细胞有丝分裂的重要微管相关激酶[3]，有研究显示，DCLK1可通过对NSCLC患者的微小RNA(miRNA)-144水平的显著性抑制，进一步促进肿瘤细胞的上皮间质化，对肿瘤的进展具有重要作用[4]。GLI家族锌指蛋白3(GLI3)可通过对NSCLC癌细胞的增殖以及凋亡的调控，进而促进肿瘤细胞的转移[5]。半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)是肿瘤细胞凋亡途径中最为重要的执行因子，通过对上游信号的显著性激活，引发局部级联反应，进一步引起细胞凋亡[6]。本研究主要通过对NSCLC癌组织中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况与其淋巴结转移和预后的相关性分析，为NSCLC的临床诊断以及预后评价提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年2月至2017年3月本院诊断的NSCLC患者60例作为研究对象，其中男36例，女24例;年龄59～77岁，平均(64.24±2.09)岁；平均体质量指数(BMI)为(24.66±2.11)kg/m2；病程4～11年，平均(6.44±2.39)年；TNM分期：ⅢA期11例、ⅢB期37例、Ⅳ期12例；病理类型：腺癌32例，鳞癌28例；肿瘤位置：中央型32例，周围型28例；有淋巴结转移33例，无淋巴结转移27例。纳入标准：(1)所有患者均符合NSCLC诊断标准[7]；(2)预计生存时间>6个月；(3)心电图无异常；(4)肿瘤大小均可经CT进行测量；(5)患者卡氏评分≥70分，身体可耐受化疗。排除标准：(1)诊断或合并小细胞肺癌者；(2)治疗过程中出现严重中性粒细胞降低、神经毒性以及外周神经炎患者；(3)有严重精神障碍无法配合者；(4)有严重心脏、肝、肾功能障碍的患者；(5)对本研究药物过敏或者不耐受患者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法 所有患者均进行肺部活检，取患者的癌组织以及癌旁组织，采用石蜡包埋后进行连续切片，切片的厚度设定为4 μm，采用pH6.0的柠檬酸修复液对石蜡切片进行脱蜡以及脱水，采用高压加热法对抗原进行修复。分别采用1∶100的DCLK1、Caspase-3和GLI3抗体进行滴加，在4 ℃下孵育过夜，采用多聚物酶标二抗进行滴加后，在37 ℃下继续孵育45 min，采用二氨基联苯胺(DAB)进行显色，苏木精进行复染。细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒物即为DCLK1、Caspase-3和GLI3阳性。采用染色强度以及阳性细胞的二级计数法对DCLK1、Caspase-3和GLI3进行评分，无染色为0分，淡黄色为1分，黄褐色为2分，深褐色为3分。阳性细胞比例<10%为0分，10%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～100%为3分。将染色强度以及染色比例的评分乘积作为以上蛋白表达程度的评价依据，6分以下为低表达，6分及6分以上为高表达[8]。比较癌组织以及癌旁组织DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况的差异；比较不同病理状态、不同预后的患者癌组织DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况的差异。分别对癌组织的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况与肿瘤的淋巴结转移、预后之间的相关性进行分析。所有患者均进行安罗替尼靶向治疗3个月，且对所有患者展开为期3年的随访，以死亡作为终点事件，将其分为死亡组和生存组。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，采用Spearman相关进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1癌组织及癌旁组织的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况比较 癌组织的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于癌旁组织，DCLK1蛋白的高表达比例显著低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织以及癌旁组织中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况比较[ n(%)]

2.2不同临床特征患者癌组织中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况比较 不同性别、年龄、TNM分期患者癌组织中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况之间差异均无统计学意义(P>0.05)；腺癌患者癌组织中的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于鳞癌患者，DCLK1蛋白高表达比例显著低于鳞癌患者，差异均有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移的患者癌组织中的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于无淋巴结转移的患者，DCLK1蛋白高表达比例显著低于无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床特征患者癌组织中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况比较[ n(%)]

2.3不同预后患者癌组织中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况比较 至随访结束，死亡组20例，生存组40例。死亡组癌患者癌组织中的Caspase-3和GLI3蛋白高表达比例显著高于生存组，DCLK1蛋白高表达比例显著低于生存组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同预后患者癌组织的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表达情况比较[ n(%)]

2.4相关性分析 NSCLC的淋巴结转移以及不良预后分别与癌组织中Caspase-3和GLI3蛋白表达情况呈正相关(P<0.05)，与DCLK1蛋白表达情况呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 相关性分析

3 讨 论

NSCLC是临床发病率较高的恶性肿瘤之一[9]，疾病的早期临床症状不明显，加之早期诊断能力有限，多数患者在确诊时已处于晚期，丧失了手术治疗的最佳时机。所以在疾病的早期，通过对NSCLC患者生化指标的分析来进行临床辅助诊断对于疾病的诊治具有重要意义[10]。

在早期的研究中，DCLK1主要参与神经元细胞的逆行运输以及迁移，同时在一定程度上还参与了神经元细胞的凋亡。有研究报道，在细胞有丝分裂过程中，DCLK1可通过与微管细胞的显著性结合作用[11]，共同形成细胞骨架，同时在细胞的细胞周期以及分化过程中发挥重要作用。目前已经证实，DCLK1在胃癌、胰腺癌、结肠癌以及肝癌中呈显著高表达[12]。本研究对不同预后以及淋巴结转移情况患者的DCLK1蛋白表达情况分析发现，随着患者淋巴结转移的发生以及不良预后的发展，患者的DCLK1水平显著下降。周美玲等[13]的研究报道，DCLK1与NSCLC肿瘤细胞的淋巴结转移显著相关。随着疾病的进展，由于肿瘤细胞对正常细胞的破坏能力增强，正常细胞的骨架被显著破坏，因此患者的DCLK1水平显著下降。

GLI3蛋白是通路转录因子蛋白中的重要分子，在Hh信号通路中具有重要作用。在Hh信号通路中，GLI3蛋白通过对NSCLC肿瘤细胞增殖、凋亡以及耐药情况的介导，进而促进肿瘤进展。在动物实验中已经证实，通过对实验小鼠进行氯化钾抑制糖原合成酶激酶的作用，进一步促进GLI3蛋白的加工合成能力，在一定程度上促进了直肠癌的进展[14]。陈盈盈等[15]通过对NSCLC患者GLI3蛋白水平的分析发现，随着患者的疾病进展，患者的GLI3蛋白水平显著升高，提示在淋巴结转移过程中，GLI3蛋白还可通过血行播散等方式促进肿瘤的进展。

在NSCLC的病程中，由于肿瘤细胞对正常细胞的显著性破坏作用，局部组织的炎性反应加重，而Caspase-3主要是在Nod样受体家族pyrin结构域蛋白3(NLRP3)的C末端进行胱天蛋白募集以及在热蛋白结构域的作用下形成，在此形成过程中，由于炎性反应被显著激活，局部炎性反应水平呈级联式增长，进一步造成正常细胞的凋亡。肖丽娜等[16]在对NSCLC患者Caspase-3表达水平与肿瘤细胞凋亡情况的分析中发现，患者的Caspase-3水平与肿瘤细胞的凋亡呈正相关。

综上所述，NSCLC的淋巴结转移以及不良预后分别与癌组织中Caspase-3和GLI3蛋白表达情况呈正相关，与DCLK1蛋白表达情况呈负相关，可为日后临床诊断提供依据。但本研究也存在一定的局限性，如样本量较小，所选取的患者均为中晚期患者等，有待后续进一步研究。