四川猕猴桃灰霉病菌对4种杀菌剂的抗药性检测

裴艳刚　朱宇航　岁立云等

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猕猴桃Actinidia chinensis Planch因含有多种微量元素、氨基酸及丰富的维生素和矿物质，被誉为“水果之王”。猕猴桃原产于中国，20世纪40年代，经新西兰培育后广泛种植，现已成为世界上重要的经济作物之一。随着国内猕猴桃栽培面积的不断扩大，灰霉病在四川、陕西和湖北等全国各地的猕猴桃产区均有发生，猕猴桃灰霉病的危害也日益突出，成为猕猴桃的主要病害之一。灰霉病菌Botrytiscinerea在猕猴桃生长期侵染叶片、花萼和果实，造成落叶、花腐和果腐症状，在贮藏期造成果实软腐，严重威胁猕猴桃产业的健康发展。目前国内外对于猕猴桃灰霉病的防治仍以化学防治为主，用于生产上防治灰霉病的药剂主要有苯胺基嘧啶类、苯吡咯类、二甲酰亚胺类和酰胺类化学杀菌剂。由于灰霉病菌具有繁殖迅速、遗传变异快和适应力强等特点，这些杀菌剂的连续使用使其极易产生抗药性，导致灰霉病菌对很多不同类型杀菌剂产生不同程度的抗性。据报道，湖南、福建、江苏和山东等多个地区的葡萄、草莓、番茄、黄瓜等果蔬植物上的灰霉病菌已经对嘧霉胺、腐霉利两种传统化学药剂产生较高的抗药性;在日本大阪番茄上、我国江苏草莓上的灰霉菌对异菌脲抗性频率分别高达86.4%、64.6%;苯吡咯类杀菌剂咯菌腈作为一种新型杀菌剂具有较好的田间防控效果，2019年山东蓬莱葡萄灰霉菌对咯菌腈抗性频率仅为9.47。前人对以上几种杀菌剂进行抗药性检测的结果表明，不同寄主植物、不同生态区的灰霉病菌的抗性频率不尽相同。

近年来关于灰霉病菌抗药性的报道多见于葡萄、番茄、草莓等寄主植物，针对猕猴桃灰霉病抗药性的研究鲜有报道，在实际生产中用于猕猴桃灰霉病菌防控的药剂种类和施药频次亦未见报道，四川猕猴桃灰霉病菌对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和异菌脲等几种常见杀菌剂的抗药性尚不明确。本试验基于田间防控灰霉病用药的实际情况，广泛采集四川主要猕猴桃产区灰霉病样本，并采用MIC法测定猕猴桃灰霉菌对4种杀菌剂的抗药性，旨在探明猕猴桃灰霉病菌对常见杀菌剂的抗性频率、敏感类型及多重抗药性，为猕猴桃灰霉病药剂的选择提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试药剂

97%嘧霉胺原药、98%咯菌腈原药、98%腐霉利原药、96%异菌脲原药均由四川国光农化股份有限公司提供。

1.2四川省猕猴桃灰霉病田间用药情况调查

2016年3月至2018年11月，在四川都江堰、彭州、双流、蒲江、雅安、绵竹、苍溪和安州等猕猴桃种植区随机选择125个发生灰霉病的果园，调查并记录种植户在栽培管理过程中为防控猕猴桃灰霉病施用的药剂名称及次数，统计主要药剂种类和施用的频次。根据调查结果，结合其他寄主灰霉病的抗药性检测情况，最终筛选出用于四川猕猴桃灰霉病菌的抗药性检测的药剂。

1.3菌株的采集与分离

2016年—2018年，从四川都江堰、彭州、双流、蒲江、雅安、绵竹、苍溪和安州等8个猕猴桃主要种植区采集猕猴桃病叶、病花和病果，症状如图1所示。将采集的样品带回实验室18～20℃湿润培养2d后，将具有灰霉病特征的病组织放置于解剖镜下，采用龚国淑等的单孢分离法在PDA培养基上进行纯化，再利用形态特征结合分子生物学方法进行鉴定，共获得灰葡萄孢菌122株（表1），于4℃冰箱保存备用。

1.4含药培养基的制作

嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和异菌脲的鉴别浓度分别为1.0、0.1、1.0μg/mL和5.0μg/mL。准确称取各种原药0.1 g，然后用丙酮溶解后加入少量吐温-80乳化，配制成浓度为1000μg/mL的母液，再用灭菌水将嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和异菌脲的母液稀释为鉴别浓度的10倍，分别为10、1、10、50μg/mL。在无菌环境下，分别将稀释后的4种药剂溶液与灭菌后冷却到60℃的PDA培养基按1：9比例混合充分摇匀，配成最终浓度为1.0、0.1、1.0μg/mL和5.0μg/ml_的含药培养基，倒入直径90 mm的培养皿中，以无菌水代替药剂作为对照，用于抗药性测定。

1.5猕猴桃灰霉病菌对4种杀菌剂抗药性频率的测定

采用最低抑制浓度法（MIC法）检测猕猴桃灰霉病菌对不同杀菌剂的抗药性频率。将菌种在PDA培养基上20℃下活化3d后，再转至d=90 mmPDA平板上培養3d。用5mm灭菌打孔器打取菌落边缘生长一致的菌饼若干，接种于含药的PDA平板中央，每皿放置一块，每处理3个重复，置于20℃恒温培养箱中持续培养3d，敏感菌株的界定为不能或几乎不能在鉴别浓度下正常生长，抗性菌株为能在该浓度下正常生长。

1.6统计分析

采用Excel软件统计各个区域的抗性菌株发生频率和抗性类型。

抗性频率=抗性菌株数/所测菌株总数×100%。

2结果与分析

2.1四川猕猴桃灰霉病防控的药剂种类及施用情况

对四川125个猕猴桃果园用药情况的调查及数据统计结果表明，种植户针对猕猴桃灰霉病防控所施用的药剂（主要成分）主要有嘧霉胺、异菌脲、腐霉利、啶酰菌胺、嘧菌环胺、多菌灵、甲基硫菌灵和咯菌腈等8种（表2）。2016年上述8种药剂的施药次数分别为165、86、87、23、16、26、15次和13次，累计施药431次，平均每个果园施药3.45次;2017年施药次数分别为145、96、74、36、18、22、17次和12次，累计施药420次，平均每个果园施药3. 36次;2018年施药次数分别为141、128、72、54、25、17、15次和15次，累计施药467次，平均每个果园施药3. 74次。嘧霉胺、异菌脲和腐霉利连续3年被高频施用，但啶酰菌胺、嘧菌环胺、多菌灵、甲基硫菌灵和咯菌腈施用频次相对较低。其中嘧霉胺施用频次最高，2016年2018年3年中分别占总施用次数的38. 28%，34.52%和30.19%，呈现下降趋势。同样，腐霉利和多菌灵等传统杀菌剂施用频次均有不同程度下降;相反，异菌脲和啶酰菌胺施用频次逐年增加，逐渐成为四川猕猴桃灰霉病防控的主要杀菌剂;嘧菌环胺、甲基硫菌灵和咯菌腈等施用频次无明显变化，仅在个别果园施用。根据以上结果可知，嘧霉胺、异菌脲和腐霉利这3种药剂被大部分种植户用于猕猴桃灰霉病的防控，故猕猴桃灰霉病菌对这3种药剂的抗药性情况亟须探明，另根据郑媛萍等、纪明山等、李若晨等研究发现咯菌腈对其他寄主灰霉病菌防控效果较好，最终选择嘧霉胺、异菌脲、腐霉利和咯菌腈4种药剂用于抗药性检测，以进一步探究四川猕猴桃灰霉病菌对这4种药剂的抗药性状况。

2.2猕猴桃灰霉病菌的抗性频率和分布

由表3可知，四川8个猕猴桃种植区的122个灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株群体对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和异菌脲的抗性频率分别为95. 08%、86. 07%、80. 33%和5.74%。其中對嘧霉胺敏感菌株有6株，抗性菌株有116株;对咯菌腈敏感菌株有17株，抗性菌株有105株;对腐霉利敏感菌株有24株，抗性菌株有98株;对异菌脲敏感菌株有115株，抗性菌株有7株。表明四川省猕猴桃灰霉病菌群体对嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利3种药剂已产生了较强的抗药性，且抗性频率都在80%以上，以嘧霉胺最高;试验菌株对异菌脲的抗性频率最低。针对同一药剂，不同种植区的菌株抗性频率不同，蒲江与雅安菌株对咯菌腈的抗性频率均为100%，但绵竹与彭州菌株的抗性频率分别是69. 23%和70. 00%;都江堰与安州菌株对腐霉利的抗性频率均达到90%以上，而雅安菌株的抗性频率只有66. 67%;蒲江、雅安与苍溪3个区域未检测到对异菌脲表现抗性的菌株。综上表明，四川猕猴桃灰霉病菌已对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利产生了较高的抗药性，对异菌脲产生了较低的抗药性，迫切需要筛选新的杀菌剂防治猕猴桃灰霉病。

2.3猕猴桃灰霉病菌敏感性类型

根据对不同杀菌剂抗感性的不同，将122个菌株分为8种敏感性类型（表4），各类型分别占总菌株数的65. 57%、10. 65%、7.38%、5.74%、5.74%、2.46%、1.64%、0. 82%。其中Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S类型（对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利表现抗性，对异菌脲表现敏感）（图2）的菌株有80株，占全部菌株的65. 57%，表明大部分菌株对嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利产生抗性，而对异菌脲敏感。在122个灰葡萄孢菌株中，单抗菌株共12株，占总菌株数的9. 84%;双抗菌株共23株，占总菌株数的18. 85%;三抗菌株共80株，占总菌株的65. 57%;对4种杀菌剂均产生抗性的菌株7株，占总菌株数的5.74%。说明四川省不同种植区的猕猴桃灰霉病菌抗药性以三抗类型Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S为主，在防治猕猴桃灰霉病时，连续多次施用嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利，导致猕猴桃灰霉病菌对这3种药剂产生了抗药性。异菌脲可以起到一定的防治效果。

3结论与讨论

灰霉病菌具有繁殖快，遗传变异快，适应能力强等特点，连续施用同一种化学药剂容易产生抗药性。本文结合实际生产中施用药剂的种类和频次，对四川猕猴桃灰霉病菌进行了抗药性检测，研究结果表明，来自四川猕猴桃的灰葡萄孢群体对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和异菌脲等4种常用杀菌剂已产生了不同程度的抗药性。其中嘧霉胺、腐霉利和异菌脲是防控灰霉病的传统药剂，已有多个省份报道在其他作物上产生了抗药性，且抗性频率较高。这3种药剂也是四川猕猴桃灰霉病防控中施用频率最高的药剂，其中对嘧霉胺和腐霉利已产生较高的抗药性。异菌脲与腐霉利同属于二甲酰亚胺类杀菌剂，具有多作用位点，作用机理相似，且常常存在交互抗性，本试验中猕猴桃灰霉病菌对异菌脲的抗性频率（5.74%）远低于腐霉利（80.33%），究其原因主要是腐霉利应用到猕猴桃灰霉病防治的时间更早，长期地施用导致灰霉病菌对其抗药性更强。根据田间调查，咯菌腈仅偶尔用于防治猕猴桃灰霉病，但本研究显示已产生了较高的抗药性，关于灰霉病菌对咯菌腈的抗药性鲜有报道，其抗药性的产生是否与防治猕猴桃其他病害有关还有待调查。

灰葡萄孢对杀菌剂具有丰富的敏感性类型可能与用药历史，用药水平、施药方法、气候特征、栽培条件等密切相关。本文发现四川猕猴桃灰霉病菌对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利、异菌脲共有8种敏感性类型，以三抗类型Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S（对嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利表现抗性，对异菌脲表现敏感）类型为主（占65.57%），在8个猕猴桃产区均有发现，说明嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利等3种杀菌剂对猕猴桃灰霉病的防治效果已不佳，且不宜混用。这一结果与乔广行、刘圣明、张亚和郑媛萍等人在番茄、草莓、葡萄等上的检测结果相似，灰霉菌群体具有丰富的敏感性类型，且以抗多种杀菌剂的敏感性类型为主。但在四川猕猴桃灰霉病菌群体中发现的敏感性类型比其他作物更加丰富，可能由于四川潮湿多雨，灰霉病易暴发，加上猕猴桃产值高，果农为了快速控制病情，常常多种杀菌剂同时施用和频繁施用，且随意提高施用浓度，势必导致多重抗药性的产生。应注意药剂的交替使用，并进一步监测猕猴桃灰霉病的周年流行动态，提前做好预测预报，避免盲目用药。

本文在明确四川猕猴桃灰霉病菌对常用杀菌剂的抗药性的前提下，建议在猕猴桃产区限制使用嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利等3种杀菌剂，而异菌脲应与其他杀菌剂轮换使用，避免长期、大量地在同一产区使用。同时，还需进一步对更多杀菌剂进行抗药性检测，掌握灰霉病菌对不同杀菌剂抗性变化趋势，筛选并应用高效防控药剂。另外，还需建立完善的病害预测预警体系，合理搭配猕猴桃抗病品种，建造避雨设施及其配套措施，从而达到对猕猴桃灰霉病的绿色综合防控。