江苏人工养殖团头鲂嗜水气单胞菌感染的调查分析

谢 理，高 崧，高清清，邹 园，范小敏，蔡泽文，阳 涛，李 茂

(1.扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/农业部禽用生物制剂重点实验室，江苏扬州 225009；2.四川德康农牧食品集团股份有限公司，四川成都 610225；3.通威股份有限公司，四川成都 610041)

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)属弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，为革兰氏阴性短杆菌，在下水道、化粪池、池塘、底泥、河道、湖泊、运输工具中都存在，是一种广泛存在的共栖菌[1]。随着研究的深入，发现人-兽-鱼共患病病原菌中就有嗜水气单胞菌，可感染大部分水生和陆生动物，对鱼类的危害尤其突出[2]，在很多人类腹泻的病例中都能检测到致病性嗜水气单胞菌[3]。团头鲂(Megalobramaamblycephala)俗称武昌鱼，我国团头鲂养殖第一大省是湖北，第二大省是江苏，江苏省2018年团头鲂有16.57万吨产量[4]。规模和集约化养殖程度越来越高，水质环境压力巨大，由嗜水气单胞菌等细菌引发的细菌性败血症危害越来越严重[5]。尤其以嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病危害最为严重，具有季节性、发病率高、发病快、持续时间长、死亡率高等特点[6]。嗜水气单胞菌危害范围广泛，且致病力强，对团头鲂养殖造成了巨大的经济损失。为了阐述嗜水气单胞菌对江苏团头鲂养殖的危害现状，掌握病害的流行规律、暴发条件等，对江苏省团头鲂主要人工养殖地区进行了调查和检测，以期为把握团头鲂源嗜水气单胞菌的流行性特征提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2018年4月至2018年10月，在江苏省无锡宜兴、常州武进、溧阳和金坛、淮安宝应、宿迁泗洪等6个市(区、县)团头鲂主产区149个疑似患细菌性败血症的团头鲂养殖场，选择表现为游边，鳍条、下颌和腹部出血的病鱼，送实验室进行病原分离鉴定。

1.1.2 试验用动物 从江苏武进某养殖场购入规格大小基本一致的团头鲂200尾，体重为50 g±5 g。试验鱼在水族箱内暂养14 d，镜检无寄生虫，内脏未分离到嗜水气单胞菌，确认健康后用于试验。

1.1.3 主要试剂 细菌DNA提取试剂盒购自洛阳爱森生物科技有限公司；细菌生化微量鉴定管、革兰氏染色试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司；LB液体培养基、营养琼脂培养基、TSA培养基，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器 恒温水浴锅，山东博科生物产业有限公司产品；恒温培养箱，成都晟杰科技有限公司产品；梯度PCR仪和凝胶成像系统，美国伯乐公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化及形态特征观察 在无菌条件下，用750 mL/L的酒精擦拭患细菌性败血症病鱼(下颌、鳃盖、腹部、鳍条或肌肉出血)体表，用灭菌的解剖剪从腹部后方(泄殖孔前方)剖开病鱼，观察病鱼内脏器官病变情况。接种环从肝脏、腹水、脾脏、肾脏中取病样接种于TSA培养基上，28℃培养24 h后选择优势菌落进行纯化，纯化后甘油保存备用。分离的细菌28℃培养24 h后，革兰氏染色，用显微镜观察细菌形态。

1.2.2 细菌的生化鉴定 按照GB/T 18652-2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》中规定的方法进行。

1.2.3 16S rRNA-PCR鉴定 经过生化鉴定的为嗜水气单胞菌的菌株再进行16S rRNA-PCR鉴定。待检测株接种于LB液体培养基中28℃恒温振荡培养16 h，菌株DNA提取按照DNA提取试剂盒说明书进行。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，上游引物序列为：5′-GAAAGGTTGATGCCTAATACG-3′，下游引物序列为：5′-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3′。反应体系20 μL：模板DNA 2 μL，dNTP 2 μL，buffer 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min，程序结束。扩增产物纯化后，由生工生物工程(上海)有限公司完成测序。

1.2.4 动物回归感染试验 经生化和16S rDNA鉴定均为嗜水气单胞菌的菌株中，随机选择5个菌株做动物回归感染试验。将保存在300 mL/L甘油中的菌株接种于TSB培养基中28℃培养24 h，通过麦氏比浊法用生理盐水配成1×106CFU/mL。每个攻毒株设置3个平行组，每组10尾鱼，每尾鱼腹腔注射0.1 mL菌液。设置对照组(注射0.1 mL生理盐水)，连续观察至攻毒后7 d。

1.2.5 现场流行病学调查 对团头鲂规模化养殖场发病塘口进行细菌性败血症发病情况调查。调查方式以走访、定点跟踪等进行。调查内容为团头鲂发病时间、病鱼规格、发病率、死亡情况、临床症状、用药情况和水质情况等。

2 结果

2.1 细菌形态特征

培养出的菌落形态一致，形成微凸光滑、边缘齐整、有一定透明度和特殊气味的乳白色菌落(图1)。菌落直径小的0.1 mm～0.5 mm，大的1 mm～2 mm。显微镜观察到该菌两端圆，呈单个或多个排列。经革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌(图2)。

这是谁啊？怎么如此陌生而又熟悉……我突然记起她是我小时候的玩伴，内心陡然涌起一股洪波。我只顾欣赏她的美色，惊讶于她那炫目的亮丽，差点儿忘了辨认她是谁？我在大脑的沟回里搜索了好一阵，才找出她的姓名——白丽筠。她是我小学时的同学，跟我家住过隔壁，没等到上初中就因为搬家分手了。这些年来我们几乎没有什么联系，偶尔见面也只是腼腆地笑一笑。而我上大学之后这几年，几乎连见一面的机会也没有。

图1 菌落形态

图2 革兰氏染色细菌形态

2.2 生化鉴定结果

对分离的149株细菌进行生化鉴定，其中117株进行生理生化鉴定的结果显示AHM+、革兰氏染色-、VP试验+、吲哚试验+、氧化酶+、甘露醇+、水杨素+、七叶苷+、阿拉伯糖+、蔗糖+、葡萄糖+、乳糖-，与国家标准中检测嗜水气单胞菌鉴定方法中结果相一致。

2.3 16S rRNA PCR鉴定结果

将生化鉴定阳性的117株菌株进行PCR扩增，部分电泳结果见图3。与GenBank中已知的嗜水气单胞菌16S rRNA基因序列进行比对，鉴定结果表明其中101株细菌为嗜水气单胞菌，其余16株细菌鉴定至气单胞菌属。从江苏6个市(区、县)发病塘口的团头鲂体内分离培养出细菌，其中嗜水气单胞菌101株，占67.80%(表1)。武进分离出嗜水气单胞菌30株，宜兴分离出嗜水气单胞菌32株，溧阳分离出嗜水气单胞菌12株，宝应分离出嗜水气单胞菌9株，金坛分离出嗜水气单胞菌占8株，泗洪分离出嗜水气单胞菌10株。嗜水气单胞菌几乎感染0.1 kg以上每个阶段的鱼，0.1 kg～0.2 kg阳性率为56.25%，0.2 kg～0.3 kg阳性率为76.12%，0.3 kg～0.5 kg阳性率为67.74%，0.5 kg以上阳性率为57.89%(表2)。

表1 不同采样地区嗜水气单胞菌阳性率

表2 不同规格团头鲂的嗜水气单胞菌检测结果

2.4 动物回归感染试验结果

攻毒组的试验鱼约12 h后开始出现死亡，对照组一直未有死亡。死鱼体表特征不明显，未见出血斑，部分肛门红肿，剖检可见腹腔积液。从濒死鱼中分离细菌并鉴定，仍为嗜水气单胞菌。

M.DNA标准 DL 2 000；1～12.分离菌株；N.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000；1-12.Strains；N.Negative control

2.5 现场流行病学调查结果

现场调查发现，宜兴、武进、溧阳、金坛4个江苏南部地区发病时间集中在5月～10月，其中6、7月为高发期。江苏北部宝应、泗洪地区比苏南晚半个月左右发病，集中发病时间为6月～10月份，其中7、8月份是高发期。暴发水温26℃～35℃，尤以30℃～34℃为高发水温。发病对象为0.1 kg～0.8 kg大小的团头鲂成鱼与鱼种，发病速度快，发病率可达90%，死亡率超过10%。同时套养的鲫鱼、鳙鱼、草鱼等也可同时出现大量死亡。

3 讨论

嗜水气单胞菌引发的细菌性败血症是一种暴发性流行病，20世纪70年代末80年代初发病较少。主要感染鲫、鳊、鲢、鳙、鲤、鲮等鲤科鱼类，也可感染非鲤科鱼类、石斑鱼[7]、鳖、蛙、鳗、黄鳝、河蟹[8]、克氏原螯虾[9]等养殖品种。2018年对江苏省6个团头鲂养殖主产区调查，发现嗜水气单胞菌感染后发病快，发病率高，死亡率超过10%，同时还会引起套养鱼大量死亡。用敏感抗生素能迅速控制病情，但养殖户长期超剂量用抗生素，使临床菌株耐药性非常普遍。药物治疗控制疫情后，发病塘口后续还会反复，甚至出现2次、3次暴发。

嗜水气单胞菌病暴发不仅与温度有关，还与水质环境有关，溶解氧低、亚硝酸盐含量高是诱发出血病的重要水质因素，这可能是不良的水环境刺激鱼体，降低鱼体免疫力造成的。经过调查还发现嗜水气单胞菌引发的团头鲂细菌性败血症高发的原因主要是：①放养密度过大，2 000尾/亩～4 000尾/亩。②为了追求养殖效益，大量投喂饲料，造成水质恶化。③池塘管理差，未能定期消毒。

本次调查发现各区域发病鱼嗜水气单胞菌阳性率无显著性差异，平均阳性率为67.79%，可能是本研究集中在发病鱼的分离鉴定，所以与健康鱼携带嗜水气单胞菌检测结果差异较大。也可能是团头鲂相较于其他鱼品种，更容易受到嗜水气单胞菌的感染。说明嗜水气单胞菌的感染存在较大的差异性，应根据不同的养殖品种和区域进行研究。重量为0.2 kg～0.3 kg的团头鲂嗜水气单胞菌阳性率最高为76.12%，原因可能是经过前期投喂饲料，沉积在鱼塘的饲料为细菌的生长提供了营养。进入到6月水温达到26℃适宜细菌滋生，该季节重量在0.2 kg～0.3 kg的团头鲂较多。

嗜水气单胞菌的鉴定方法有多种，生化试验和血清学方法能初步判断细菌种类，分子生物学方法能够快速、准确、简便地判定细菌种类。有研究用PCR扩增16S rRNA基因成功检测出患病鳗鲡中的嗜水气单胞菌[12]，通过16S rRNA基因的扩增检测出从患病瓦氏黄颡鱼中分离出的细菌为嗜水气单胞菌[13]。本研究采用革兰氏染色、菌落观察、镜检、生化试验、分子生物学方法、动物回归试验对细菌进行鉴定，从149个分离株中鉴定出101株为嗜水气单胞菌，为江苏地区团头鲂嗜水气单胞菌感染的防控提供了科学依据。