非洲猪瘟病毒p72和CD2v双基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

蔡晓丽，区贤斌，李雪平

(1.广州华医测检测科技有限公司，广东广州 510300；2.广州悦洋生物技术有限公司，广东广州 510300)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病。ASF在1921年于非洲的肯尼亚发生，其后扩散到非洲各国及欧洲、南美洲。2007年以来，ASF在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。该病早期发现难、防控难、根除难，被称作养猪业的头号杀手，我国将其列为一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告动物疫病。自从2018年ASF传入我国后，给养猪业造成巨大的损失。ASFV属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属成员，只有1个血清型，可分为24个基因型[1]。其基因组为170 kb～190 kb的双链DNA。ASFV 基因组中存在150多个开放阅读框(ORF)，成熟病毒粒子中含有68 种结构蛋白[2]。ASFV的B646L基因高度保守[3]，编码p72蛋白，是病毒粒子结构的组成部分；EP402R基因全长约1 083 bp，编码CD2v蛋白，大小约39.6 ku，也是病毒粒子的结构蛋白。在我国暴发ASF的ASFV分离株属于ASFV Ⅱ型。实时荧光定量PCR方法具备快速、准确、灵敏度高的特点，目前已成为诊断ASF的主要方法。国内外已建立了多种荧光定量PCR方法检测ASFV。2005年，Zsak L等建立了一套针对p72基因保守区域荧光PCR方法[4]，Tignon M等也建立了针对p72基因和ACTB内参基因的二重荧光PCR方法[5];董志珍等针对p54基因开发荧光PCR方法[6]。但目前国内未见有同时检测ASFV 2个基因的双重荧光定量PCR方法的报道。针对一种疫病同时检测2种基因可以提高其特异性。因此，本研究以ASFV p72和CD2v基因为靶序列，分别设计特异性引物和TaqMan探针，通过优化反应体系，目的是建立可同时检测p72和CD2v基因的双重荧光定量PCR方法，既可确定是否感染ASFV，也可用于检测ASFVCD2v基因缺失株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准品 非洲猪瘟病毒Ⅱ型(ASFV Ⅱ型)基因组DNA，浓度0.73×103copies/μL～2.45×103copies/μL购自青岛立见诊断技术发展中心。

1.1.2 非洲猪瘟病毒株 非洲猪瘟病毒株来自广东省动物卫生监督所，是广州华医测检测科技有限公司2019年5月份参加广东省非洲猪瘟能力验证所留存样品，编号分别为A32、A193、A51、A99、A174，为含灭活病毒的血样。

1.1.3 疫苗株 猪瘟活疫苗，购自广东永顺生物制药有限公司；猪传染性胃肠炎灭活疫苗、猪流行性腹泻灭活疫苗，购自武汉科前生物股份有限公司；猪肺炎支原体活疫苗，购自齐鲁动物保健品有限公司；口蹄疫灭活疫苗，购自天康生物有限公司；猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，购自中牧实业股份有限公司。

1.1.4 主要试剂 Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒，购自天根生物科技有限公司；PEASY-T1 Simple Cloning Kit，购自北京全式金生物技术有限公司；TaqPCR Master Mix (2×)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqManTMFast Advanced Master Mix (2×)、ABI StepOne Plus，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.1.5 主要仪器 荧光定量PCR仪(StepOne Plus)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；凝胶成像系统(Tanon 1600)、电泳仪(EPS 300)，上海天能科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸的提取 采用Mini BEST Viral RNA /DNA Extraction Kit Ver．5.0，按照说明书进行操作，分别提取非洲猪瘟病毒(灭活)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪肺炎支原体的核酸，主要的提取过程是：取200 μL样品，加入200 μL的bufferVGB、20 μL的Proteinase K和1.0 μL的Carrier RNA，充分混匀，于56℃水浴温浴10 min。向裂解液中加入200 μL无水乙醇，充分吸打混匀。将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 r/min离心2 min，弃滤液。将500 μL的buffer RWA加入Spin Column中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。将700 μL的buffer RWB加入Spin Column中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。重复上一步骤。将Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 r/min离心2 min。将Spin Column安置于新的1.5 mL RNase free collection tube上，在Spin Column膜的中央处加入30 μL～50 μL的RNase free dH2O，室温静置5 min。12 000 r/min离心2 min洗脱DNA/RNA。将提取的核酸置于-20℃保存备用。

1.2.2 引物和探针的设计合成 根据非洲猪瘟病毒流行毒株Pig/CN/HLJ/2018(GenBank：MK333180.1)分别设计B646L(P72)和EP402R(CD2v)基因保守区引物和探针。引物和探针序列均由上海生工合成。序列见表1。

表1 ASFV p72和CD2v的特异性引物和荧光标记探针

1.2.3 非洲猪瘟病毒B646L(p72)和EP402R(CD2v)阳性质粒构建 以p72-F、p72-R上、下游引物扩增，按照TaqPCR Master Mix(2×)产品说明书，扩增ASFV核酸。体系为：TaqPCR Master Mix(2×)25 μL，上游引物p72-F(10 μmol/L)、下游引物p72-R(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL，去离子水19 μL。反应程序：预变性94℃ 4 min；变性94℃ 30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，35个循环；72℃ 延伸10 min。切下扩增目的条带，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书进行胶回收。按照PEASY-T1 Simple Cloning Kit说明书，将目的片段与PEASY-T1载体连接，转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，挑选阳性重组克隆，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。将正确插入p72基因目的片段的阳性克隆质粒命名为T1-p72。CD2v阳性质粒构建基本步骤与p72阳性质粒相同。

以CD2v-F、CD2v-R上、下游引物扩增ASFV CD2v基因，反应体系如上。反应程序：预变性94℃ 4 min；变性94℃ 30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，35个循环；72℃ 延伸10 min。将扩增目的片段与PEASY-T1载体连接，转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，挑选阳性重组克隆，由上海生工生物工程有限公司测序鉴定。将正确插入CD2v基因目的片段的阳性克隆质粒命名为T1-CD2v。

阳性质粒拷贝数的计算公式为：(6.02×1023copies)×(OD260)×稀释倍数×50 ng/μL×10-9)/(DNA碱基数×660 g/mol)=copies/μL。用核酸蛋白分析仪分别测定T1-p72、T1-CD2v浓度并经公式计算，得到T1-p72和T1-CD2v每微升样品拷贝数分别为5.02×109个和7.7×109个。

1.2.4 双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.2.4.1 p72单次荧光定量PCR反应条件的优化 用浓度为5.02×105copies/μL的T1-p72阳性质粒为模板，对PCR体系引物、探针浓度进行优化，反应体系25 μL，使用赛默飞Mix，引物浓度范围从0.2 μmol/L～0.8 μmol/L以0.1 μmol/L递增，探针浓度范围从50 nmol/L～250 nmol/L以50 nmol/L递增，采用矩阵法优化引物和探针的最优浓度配比。

1.2.4.2 CD2v单次荧光定量PCR反应条件的优化 用浓度为7.7×105copies/μL的T1-CD2v阳性质粒为模板，对PCR体系引物、探针浓度进行优化，反应体系25 μL，使用赛默飞Mix，引物浓度范围从0.2 μmol/L～0.8 μmol/L以0.1 μmol/L递增，探针浓度范围从50 nmol/L～300 nmol/L以50 nmol/L递增，采用矩阵法优化引物和探针的最优浓度配比。

1.2.4.3 p72-CD2v双重荧光定量PCR反应条件的优化 以浓度为5.02×105copies/μL的T1-p72阳性质粒、7.7×105copies/μL的T1-CD2v阳性质粒为模板，采用赛默飞PCR Mix，在已确定引物探针浓度的p72和CD2v单次荧光基础上，然后对25 μL双重荧光定量PCR反应体系下的混合引物和探针浓度，以及对56℃～60℃范围内的退火延伸温度做进一步优化试验，以确定最适的反应条件。

1.2.4.4 标准曲线建立 分别对T1-p72和T1-CD2v阳性质粒进行10倍系列稀释，使其浓度范围分别为5.02×101copies/μL～5.02×109copies/μL和7.7×101copies/μL～7.7×109copies/μL，在优化的25 μL双重荧光PCR反应体系下，吸取模板1 μL，对每个稀释度的T1-p72、T1-CD2v阳性质粒各吸取1 μL为模板进行荧光PCR扩增，反应结束后分别以T1-p72、T1-CD2v模板拷贝数为横坐标，以CT值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4.5 最低检出限 对非洲猪瘟病毒(ASFV Ⅱ型)基因组DNA标准物质进行10倍倍比稀释，使其浓度为0.73×102copies/μL～2.45×102copies/μL、0.73×10 copies/μL～2.45×10 copies/μL，用建立的双重荧光定量PCR反应体系检测，每个浓度重复20次，以95%概率检出，即19次为阳性确定该方法的最低检出限。

1.2.4.6 重复性和特异性 分别选取3个浓度的T1-p72阳性质粒(5.02×103copies/μL～5.02×105copies/μL)和T1-CD2v阳性质粒(7.7×103copies/μL～7.7×105copies/μL)，按优化的双重荧光定量PCR反应条件进行试验，分别进行组内和组间实验，以确定该方法重复性。以猪瘟疫苗、口蹄疫疫苗、猪繁殖与呼吸综合症疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪流行性腹泻疫苗的RNA和猪圆环2型疫苗、猪肺炎支原体疫苗的DNA为模板，按优化的双重荧光定量PCR反应条件进行检测，以确定该方法的特异性。

1.2.4.7 临床样本检测 检测2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本，2019年5月留存的非洲猪瘟病毒(灭活)参考样品5份，其中A32和A193为阴性，A51、A99、A174为阳性。上述样品经常规处理后，采用Mini BEST Viral RNA /DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒，按操作说明书提取样品RNA/DNA，用建立的双重荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 非洲猪瘟病毒B646L(p72)和EP402R(CD2v)阳性质粒构建

分别以p72-F、p72-R上、下游引物，CD2v-F、CD2v-R上、下游引物扩增ASFV核酸，经琼脂糖凝胶电泳后，p72在160 bp处有明显条带、CD2v在144 bp处有明显条带(图1)。测序后，T1-p72、T1-CD2v的插入片段用DANSTAR软件与Pig/CN/HLJ/2018进行序列比对，同源性为100%。

M.DNA标准DL 700; 1.p72扩增片段; 2.CD2v扩增片段；3.p72和CD2v的双重PCR扩增片段

2.2 p72基因荧光定量PCR反应条件的优化

用浓度为5.02×105copies/μL的T1-p72阳性质粒为模板，对PCR体系引物、探针浓度进行优化，最终确定p72单次荧光定量PCR反应的最优体系是：12.5 μL 赛默飞Mix，上、下游引物p72-F、p72-R浓度各为0.6 μmol/L，探针p72-P浓度0.1 μmol/L。模板5 μL，加去离子水补足至25 μL。反应程序：50℃ 2 min，95℃ 20 s。然后95℃ 1 s，59℃ 20 s，45个循环，在每一次循环的59℃ 延伸扩增结束前采集FAM 通道荧光信号。在此体系下，浓度为5.02×105copies/μL的T1-p72阳性质粒，呈现典型的S扩增曲线(图2A)。

A.T1-p72阳性质粒扩增曲线；B.T1-CD2v阳性质粒扩增曲线A.The amplification curve of T1-p72 positive control plasmid;B.The amplification curve of T1-CD2v

2.3 CD2v基因荧光定量PCR反应条件的优化

用浓度为7.7×105copies/μL的T1-CD2v阳性质粒为模板，对PCR体系引物、探针浓度进行优化，最终确定CD2v单重荧光定量PCR反应的最优体系是：12.5 μL 赛默飞Mix，上、下游引物CD2v-F、CD2v-R浓度各为0.4 μmol/L，探针CD2V-P浓度0.25 μmol/L。模板5 μL，加去离子水补足至25 μL。反应程序：50℃ 2 min，95℃ 20 s。然后95℃ 1 s，59℃ 20 s，45个循环，在每一次循环的59℃延伸扩增结束前采集JOE通道荧光信号。在此体系下，浓度为7.7×105copies/μL的T1-CD2v阳性质粒，呈现典型的S扩增曲线(图2B)。

2.4 p72、CD2v基因双重荧光定量PCR反应条件的优化

以浓度为5.02×105copies/μL的T1-p72阳性质粒、 浓度为7.7×105copies/μL的T1-CD2v阳性质粒为模板，采用赛默飞Mix，在已确定引物探针浓度的P72和CD2v单重荧光定量基础上，然后对双重荧光定量PCR反应体系下的混合引物和探针浓度，以及对56℃～60℃范围内的退火延伸温度做进一步优化试验，最终确定：12.5 μL赛默飞Mix，P72-F、P72-R浓度各为0.1 μmol/L，CD2V-F、CD2v-R浓度各为0.4 μmol/L，探针p72-P浓度100 nmol/L，探针CD2v-P浓度250 nmol/L，模板适量，加去离子水补足至25 μL。反应程序：50℃ 2 min，95℃ 20 s。然后95℃ 1 s，59℃ 20 s，45个循环，在每一次循环的59℃延伸扩增结束前采集FAM、JOE通道荧光信号。在最适条件下，对浓度为7.7×105copies/μL的T1-CD2v阳性质粒、浓度为5.02×105copies/μL的T1-p72阳性质粒进行扩增，呈现典型的S扩增曲线(图3)。

图3 双重荧光定量PCR T1-p72和T1-CD2v扩增曲线

2.5 标准曲线建立

对T1-p72阳性质粒、T1-CD2v阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度范围分别5.02×10 copies/μL～5.02×109copies/μL和7.7×10 copies/μL～7.7×109copies/μL，在优化的25 μL双重荧光定量PCR反应体系下，吸取模板1 μL，对每个稀释度的T1-p72、T1-CD2v各吸取1 μL为模板进行荧光PCR扩增。结果见图4A、图4B。以起始模板浓度为x轴，Ct值为y轴绘制成标准曲线(图4C、图4D)。T1-p72的定量线性范围为，5.02×10 copies/μL～5.02×109copies/μL，线性关系表达式为y=-3.502x+45.88。相关系数(r2)为0.999。T1-CD2v的定量线性范围为7.7×10 copies/μL～7.7×109copies/μL，线性关系表达式为y=-3.37x+41.094。相关系数(R2)为0.997。

A.T1-p72(5.02×10 copies/μL～5.02×109copies/μL)扩增曲线；B.T1-CD2v(7.7×10 copies/μL～7.7×109copies/μL)扩增曲线；C.T1-p72(5.02×10 copies/μL～5.02×109copies/μL)标准曲线；D.T1-CD2v(7.7×10 copies/μL～7.7×109copies/μL)标准曲线

2.6 最低检出限

非洲猪瘟病毒(ASFVⅡ型)基因组DNA标准物质10倍倍比稀释后的浓度为0.73×102copies/μL～2.45×102copies/μL、0.73×10 copies/μL～2.45×10 copies/μL，用建立的双重荧光定量PCR反应体系检测，结果表明，对非洲猪瘟病毒(ASFVⅡ型)基因组DNA标准物质0.73×10 copies/μL～2.45×10 copies/μL的检出率为100%，确定该方法最低检出限为7.3 copies/μL～24.5 copies/μL。

2.7 重复性试验

分别选取3个浓度的T1-p72阳性质粒(5.02×103copies/μL～5.02×105copies/μL)和T1-CD2v阳性质粒(7.7×103copies/μL～7.7×105copies/μL)，按优化后PCR反应条件分别进行组内和组间实验，以确定该方法重复性。表2中可以看出，T1-p72和T1-CD2v阳性质粒组内的变异系数分别0.73%～0.80%和0.48%～0.99%，组间的变异系数为0.65%～0.89%和0.63%～0.87%。

图5 标准品(0.73×10 copies/μL～2.45×10 copies/μL)重复20次的双重荧光定量PCR扩增曲线

表2 组内和组间的变异系数

2.8 特异性试验

以猪瘟疫苗、口蹄疫疫苗、猪圆环病毒2型疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、猪传染性胃肠炎疫苗、猪支原体疫苗和猪流行性腹泻疫苗的核酸为模板，按优化后双重荧光定量PCR反应条件进行检测。结果显示，仅阳性对照T1-p72和T1-CD2v有特异性扩增曲线，CSFV、FMDV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV、猪肺炎支原体均无特异性扩增。

2.9 临床样本

检测2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本，结果显示，105份样品均无非洲猪瘟病毒扩增。检测2019年5月留存的非洲猪瘟灭活样品5份，其中A32和A193为阴性，A51、A99、A174为阳性。国内非洲猪瘟疫情首次暴发于2018年8月，因此105份的检测结果与实际相符。5份留存的非洲猪瘟灭活样品的检测结果与广东省动物卫生监督所的结果一致。

图6 双重荧光定量PCR的特异性

图7 105份临床样本(A)和5份参考样品(B)双重荧光PCR的检测结果

3 讨论

实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)从1995发展至今，其高通量、快速、准确、灵敏的特点使其广泛应用于临床医学检验、动植物检疫以及食品安全等。实时荧光定量PCR被认为是ASFV检测的金标准。目前对非洲猪瘟野毒的鉴定主要是针对B646L(p72基因)[7]、D117L基因[8]、E184L基因[9]等荧光定量PCR方法。该方法可在1 h～2 h内检出猪血样、组织、饲料、环境样本是否存在非洲猪瘟病毒，为猪场的生物安全提供技术保障。但目前国内未见有检测ASFV 2个基因的双重荧光定量PCR方法。因此，本文选择p72和CD2v基因作为靶序列，分别针对这2个基因设计了2对特异性引物和探针，通过优化引物和探针的浓度，建立了ASFV双重实时荧光定量PCR检测方法，本文建立的双重荧光定量PCR扩增效率在90%～110%，符合PCR的动力学要求且线性范围横跨9个数量级别，遵循MIQE[10]和2019版OIE[11]推荐敏感性采用一定概率(95%)下最低检出限的指导原则，确定该方法的最低检出限为7.3～24.5 copies/μL，与OIE推荐的方法[12](最低检测范围是10～100 copies/μL)敏感性相当。该方法对猪瘟、口蹄疫、猪圆环病毒2型疫苗、猪繁殖与呼吸综合症疫苗、猪传染性胃肠炎、猪支原体疫苗和猪流行性腹泻疫苗等病毒核酸均无扩增，特异性强。检测了2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本，发现105份样品均无非洲猪瘟病毒检出，国内非洲猪瘟疫情首次暴发于2018年8月，105份的检测结果与临床相符。另外，对来自广东省动物卫生监督所5份非洲猪瘟参考样品进行检测，敏感性和特异性均达到100%。

本文建立的双重荧光定量PCR可在1个反应管内同时检测ASFV p72和CD2v基因。同时检测ASFV p72和CD2v基因，可降低核酸提取过程被机器打断、核酸酶降解或DNA部分丢失产生假阴性的概率，增强试剂盒的敏感性，同时提高特异性，相比分开对2个基因单独检测节约了一半时间。该方法可为动物疫病诊断和病原监测提供一种快速、敏感、准确的检测手段。