20味中药水提液对奶牛乳房炎主要致病菌体外抑菌效果筛选

谢成运，程 璐，张 娟，李勤凡,2*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐 830052)

奶牛乳房炎是目前全世界奶牛生产中最常见、最难防治的疾病之一，是制约乳业发展的重要因素，也是奶牛被淘汰的三大疾病之一，全世界每年因奶牛乳房炎造成的损失巨大[1-3]。以往治疗该病滥用抗生素，使致病菌对常用的抗生素产生了一定的耐药性，从而降低了抗生素的疗效，甚至导致奶牛泌乳能力下降，而且牛奶中有抗生素残留影响人的健康[4]。随着国家对乳制品质量有了更严格的标准，以及人们对乳品安全的要求不断提高，临床治疗奶牛乳房炎的常用抗生素逐步被限用或禁用[5]。

中药富含多种抑菌活性物质，属纯天然制品，具有无残留、无耐药性等优点，对病原菌有着直接或者间接的杀灭作用，广泛应用于畜禽疾病防治[6]。为此，本文进行了20味中药对陕西奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌试验，旨在筛选出对乳房炎致病菌有良好抑菌效果的药物，指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药 五倍子、大黄、黄连、丹参、黄柏、甘草、石榴皮、黄芩、苦参、连翘、蒲公英、地肤子、蒲黄、红花、金银花、蛇床子、乌梅、益母草、鹿蹄草、鱼腥草共计20味中药，购于杨凌同仁堂大药房。

1.1.2 菌株 菌株分离自陕西不同奶牛场临床乳房炎病例乳样，鉴定、保存于西北农林科技大学动物医学院兽医临床诊断学实验室，选取大肠埃希氏菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、产色葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌等5种菌为供试菌。取出在-80℃保存的菌株，室温解冻复苏后，接种于无菌LB液体培养基中培养复壮，随后用灭菌生理盐水稀释至1×105CFU/mL～2×105CFU/mL后备用。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱(BD115)，德国Binder公司产品；移液枪(100 μL)，德国Eppendorf公司产品；高压灭菌锅(HV-85)，日本Hirayama公司产品；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；电磁炉，广东美的集团产品。

1.2 方法

1.2.1 中药提取液制备 20味中药每味各称取30 g，碾碎后浸泡于300 mL蒸馏水中，煎煮3次，每次30 min，合并3次滤液浓缩至30 mL，得到最终浓度为1 g/mL的药液，随后高压灭菌，4℃保存备用。

1.2.2 中药抑菌试验 参照文献[7]进行琼脂扩散法的操作，在无菌条件下，用灭菌“L”型玻璃棒将菌液均匀地涂抹在琼脂平板上，6 mm打孔器打孔，火焰短暂加热封底，分别在孔内加满不同的中药提取液。37℃恒温培养箱培养24 h，测量抑菌环直径。重复3次，计算平均值，结果按照《中药药理学》标准判定。

1.2.3 最低抑菌浓度(MIC)测定和最低杀菌浓度(MBC)测定 参照文献[8]使用微量稀释法测定MIC和MBC。

1.2.4 组方的制备及效果观察 分析20味中药抑菌试验结果，选取效果较好的中药为主药，按照中药组方原则加入其他中药配伍而成。最后得到组方1(以五倍子、乌梅、黄芩为主要成分)、组方2(以五倍子、乌梅为主要成分)和组方3(以乌梅、黄连为主要成分)3种组方。采用水煎法制备提取液，减压浓缩至含药量1 g/mL，按1.2.3方法测定。

2 结果

2.1 中药抑菌试验

不同中药对不同病原菌的抑菌效果不同。黄芩、五倍子、乌梅、鹿蹄草和丹参对产色葡萄球菌为极敏，其中五倍子效果最佳；五倍子、乌梅对金黄色葡萄球菌为极敏，其中五倍子的效果最佳；五倍子、乌梅对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌为中敏，其中乌梅效果最佳；黄连、乌梅对无乳链球菌为极敏，其中乌梅效果最佳(表1)。

表1 牛乳房炎主要致病菌的中药体外抑菌试验结果

2.2 MIC和MBC的测定

黄连、黄芩、五倍子、石榴皮、乌梅、鹿蹄草对五种供试菌的抑菌效果良好。并且五倍子对金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌和无乳链球菌的抑菌效果最佳，其中对金黄色葡萄球菌和产色葡萄球菌的MIC和MBC均为0.001 g/mL，对无乳链球菌的MIC和MBC分别为0.002 g/mL和0.008 g/mL；乌梅对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌体外抑菌效果最佳，其中对大肠埃希氏菌的MIC和MBC分别为0.008 g/mL和0.016 g/mL，对肺炎克雷伯菌的MIC和MBC分别为0.016 g/mL 和0.031 g/mL(表2)。

表2 中药对供试菌的MIC和MBC试验结果

2.3 中药组方抑菌试验

3种组方对3种革兰氏阳性菌抑菌效果为极敏，对2种革兰氏阴性菌抑菌效果为中高敏，且组方效果明显都高于单味中药，其中以五倍子、乌梅为主要成分的组方2效果最好(表3)。

表3 组方对奶牛临床型乳房炎致病菌的药敏试验结果

3 讨论

在中医中，奶牛乳房炎被称为奶牛的“乳痈”，“因饲养管理不当、久卧湿热之地导致毒气侵害乳房；或因肝郁气滞、乳络失畅而致乳房气血凝滞，瘀结生痈”，会极大的影响牛奶的品质，甚至使得奶牛淘汰，对生产造成极大损失[9-10]。一般的养殖企业会选择在发病时对患病动物用抗生素治疗，中药的治疗作用往往被忽视。因此，可以参照本试验结果，以抗菌消炎、活血化淤为主要医治原则，建立一个以中药为主，同时和抗生素结合使用的疗法，以达到中西医结合，全面治疗奶牛临床型乳房炎的成果。

从试验结果可知，不同中药抑菌的有效成分不同，效果相差甚远。五倍子抑菌的主要有效成分为五倍子单宁和鞣酸；乌梅抑菌的主要有效成分为苦杏仁苷、苹果酸、枸橼酸等物质；黄连的主要有效成分为小檗碱；黄芩的主要有效成分为黄芩素、黄芩苷元等物质；鹿蹄草的主要有效成份为鹿蹄草素、没食子酸、金丝桃甙等物质；石榴皮的主要有效成分为黄酮苷、没食子酸等物质，中药成分间的差异，必然导致了各中药抑菌效果有所不同[11-16]。其次，中药的成分复杂，可能本试验所用的水提法对部分有效成分提取效率不高，而导致了结果的偏差。此外，不同细菌对于同种中药的敏感性也不尽相同，即使都使用五倍子，五种供试菌所得结果也相差巨大。最后，中药的产地、采收季节、用药部位、浓度和品质都可能会对结果产生影响。

在组方试验中，在选择体外抑菌效果较好的中药为主要成分获得一个兼具体外抗菌效果良好、制药便利和用药方便的组方的同时，也不能忽略其余抑菌效果不佳的中药，因为部分中药的主要作用不是抑菌，而是活血化淤、清热燥湿、提高机体免疫力、加快机体的恢复、缓解机体的不适感等其他重要功能。

此外，以往的试验都是以金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠埃希氏菌作为主要研究对象，而忽略了产色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等其他细菌对乳房炎的致病作用，本实验室所采病样中产色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的分离率较高，并且有文献认为产色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌同样也是重要致病菌[17-18]。本试验在前人研究的基础上，增加了对产色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的相关试验，获得了20味中药对所选5种致病菌的体外抑菌试验结果，为后续相关的研究奠定了基础。