基于微型DNA条形码的黄粉蝶亚科的物种鉴定

孙永岭，孙颖慧，赵 宇，李 娇，冀国澳，王 莹

（德州学院生命科学学院，山东德州253023）

黄粉蝶亚科(Coliadinae)隶属于鳞翅目（Lepidoptera），粉蝶科（Pieridae），是蝴蝶中较常见的类群。体中形，色彩较为素雅，多为黄色、橙色或白色，全世界已知11 属240 种，中国记载有6 属38 种。黄粉蝶亚科幼虫卵化后喜食植物叶片与幼嫩茎秆，对农林业造成严重危害。迄今为止，我国黄粉蝶亚科幼虫及卵在形态学上无法进行精准鉴别，即对有害蝶类昆虫的鉴定主要依据其成虫的外部形态，但因将幼虫饲养到成虫再鉴别这一阶段费时费力，所以探讨准确、快速、有效的黄粉蝶亚科鉴定方法很有必要。

近20年来，采用分子生物学技术对物种鉴定和分类的影响巨大，可以解决传统分类法无法高效鉴定蝶类昆虫的问题。经典分类学方法具有局限性，很难快速、有效地对所得生物样本进行鉴定。因此，2002年Tautz 等人[1]首先提出了DNA 分类的概念。随后，Herbert[2-3]所提出的线粒体COI 基因指定片段（648bp）为基础的DNA条形码（Minimalist-barcode）在新型物种基因鉴定分析方面的优势已经在学术界受到了广泛关注。但是DNA条形码技术也存在不足，DNA 容易降解这一特性制约了条形码的适用范围。当样本质量不高，存在DNA 降解情况时，常常难以获得完整的DNA 条形码信息，给不同类物种的有效鉴定工作带来极大困扰[4]。

微型DNA 条形码（Minimalist-barcode，简写为mini-barcode）技术主要是通过对中国自然科学博物馆各种鸟类标本的DNA 条形码鉴定设计得出的[5]。对于存在于博物馆里面的，且年代比较久远的生物标本或者化石中的古老物种，由于时间的流逝，DNA 片段会丢失或者受到干扰，DNA 条形码技术使用会受到很大限制。因此，Hebert 首次明确地选取了一个物种的200bp 长度的条形码并用来进行物种鉴定的微型识别基因序列，由于在200bp 指定长度的一个指定物种序列比较容易无需进行扩增鉴定即可直接获得，且通过数据采集分析和综合研究所得到的结果表明，该物种序列指定长度的一个指定物种序列长度在野外原生物种微型识别鉴定中也同样适用，所以Hebert 在论文中明确提出了微型DNA 条形码这一概念。微型DNA 条形码技术是DNA 条形码技术的应用拓展与补充延伸，通过此种技术可以更加准确、便捷的对蝶类昆虫进行鉴定，为物种鉴定等相关研究工作提供有力支撑。对于有害物种的鉴定，传统的方法存在一定的弊端。同时，在样品标本的批量采集、运输和保存等各个方面，也会导致标本DNA 发生降解，难以得到完整的DNA 条形码信息。据此，本研究以黄粉蝶亚科为研究重点对象，主要探究并讨论微型DNA 条形码对黄粉蝶亚科物种在鉴定应用方面的实施性与可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

虚拟实验中的黄粉蝶亚科36 个样本COI 片段序列均来自于BOLD 数据库(Barcoding of life data)，包括黄粉蝶亚科6 属38 种36 个样本，详细序列编号见附录1 的3—38；实体实验中黄粉蝶亚科的2 个样本材料来自山东德州岔河，分别为斑缘豆粉蝶Calias erate 和豆粉蝶Coilas hyale。

附录1 物种样本数量及来源Appendix 1 Origin and amounts of the samples used in this study

1.2 方法

1.2.1 虚拟实验

将BOLD 数据库中已经下载的黄粉蝶亚科36 个样本COI 基因局部序列用Clustal X[6]软件进行比对，并将比对之后形成的数据集按照图1表示的方式依次进行截取，将其截成长度为648bp、200bp、50bp 几个合适的片段数据集，分别标记为full-barcodeA,full-barcodeB,full-barcodeC，然后用MAGE7.0 软件对这3 个片段数据集依次构建系统发育树（Neighbor-Joining,Saitou&Nei,1987），参数为Kimura-2-parameter，再根据计算结果最终得出变异位点、简约位点、种内差异、种间差异这4 个数据。

1.2.2 实体实验

总基因组的提取：从标本蝴蝶同侧取下1—2 只足，提取总DNA。

①将取下的足剪碎后放入0.2 mL 离心管中依次加入15 μL 提取缓冲液GA（5 mmol/L ）、10 μL（20 mg/mL）的蛋白酶K 溶液，涡旋混匀10 s 后放在56 ℃的温度下孵育3 h，使样本充分降解消化，等完成后再次进行简短离心。

②加入25 μL 缓冲液GA 混匀，再加入50 μL 冲液GB 和1 μL Carner RNA 储存液，涡旋混匀10 s 后敲击至沉淀消失，然后进行简短离心以去除管盖内壁的液滴。

③加入50 μL 预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀后放置5 min 再简短离心以去除管盖内壁的液滴。

④取上清液移至一个吸附柱CR2 中，以12 000 rpm 离心30 s，弃废液。

⑤向吸附柱CR2 内加入500 μL 的缓冲液GD，再以12 000 rpm 离心30 s，弃废液。

⑥继续向吸附柱CR2 内加入600 μL 的漂洗液PW，以12 000 rpm 离心30 s 弃废液，并重复一次。

⑦再将材料以12 000 rpm 离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CR2 放置3 min 左右。

⑧将吸附柱CR2 放入1 个干净的离心管中，加入20～50 μL 的洗脱缓冲液TB，放置2～5 min 后以12 000 rpm 离心2 min。将溶液收集到离心管中。此时离心管中的溶液即为提取到的总DNA。

1.2.3 PCR 扩增

COI 基因扩增引物为 (LEPF1:5’-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’； LEPR1:5’-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)，PCR 反应体系总共加入25 μL 溶液，其中各项比例为双蒸水9.5 μL，mix 12.5 μL，引物LEPF11 μL，引物LEPR1 溶液1 μL，提取到的DNA1 μL，混合完成后放入离心机简短离心至混匀。将PCR 扩增仪设定为：第1 步预变性94 ℃5 min；第2 步变性94℃1 min；第3 步退火55℃1 min；第4 步延伸

72℃2 min。重复以上的2 到4 步30 次，最后在72 ℃下延伸10 min。设定完成后将混合溶液放入PCR 扩增仪，大约扩增2 个小时22 分钟。

1.2.4 制胶电泳

按照1:100 的比例进行配胶，经0.1%低熔点的琼脂糖凝胶电泳切胶分离后，找出所需长度的DNA 片段，用DNA 凝胶回收试剂盒（Tiangen 公司），作为测序的模板送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.2.5 测序结果

测序结果与虚拟实验中36 个样本序列结合，以DNA-barcode 指定序列5’端200 bp 为分析基础，构建系统发育树，参数为Kimura-2-parameter。

2 结果与分析

2.1 虚拟实验

虚拟实验中3 个片段数据集full-barcodeA，full-barcodeB，full-barcodeC 的序列解析结果（见表1），即已算出变异位点、简约位点、种内差异、种间差异，且以这3 个片段数据集构建的NJ 树分别见图1-A（648 bp 系统发育树）、图1-B（200 bp 系统发育树）、图1-C（50 bp 系统发育树）。

图1 基于36 个物种条形码构建系统发育树Figure 1 The Phylogenetic tree based of 36 species

表1 全长DNA 条形码与微型DNA 条形码的对比Table 1 The compare of DNA barcode and Minimalist-barcode

2.2 实体实验

将PCR 扩增及测序得到6 条648 bp 的序列，与虚拟实验中得到的36 个样本序列合并后得到38 条序列的数据集，由该数据集5’端200 bp 序列构建的NJ 树（见图2）。

3 讨论

在本实验中，我们以宽带纸弄蝶Hasora hurama、冲绳绒毛弄蝶Hasora chromus 为外群，构建NJ 树，并且从NJ 树上分析。虚拟实验full-barcodeA 的NJ 树中（见图1-A），台湾豆粉蝶Eurema alitha、尖钩粉蝶Gonepteryx mahaguru、黑角方粉蝶Dercas lycorias、檀方粉蝶Dercas verhuelli 位于一个分支，亲缘关系较近；full-barcode B的NJ 树中（见图1-B），无标黄粉蝶Eurema brigitta、尖钩粉蝶Gonepteryx mahaguru、黑角方粉蝶Dercas lycorias、檀方粉蝶Dercas verhuelli 位于一个分支，亲缘关系较近；full-barcodeC 的NJ 树中（见图1-C），尖角黄粉蝶Eurema laeta、黑缘豆粉蝶Colias palaeno、女神豆粉蝶Colias diva、镏金豆粉蝶Colias chrysotheme、玕黄粉蝶Gandaca barina 位于一个分支，亲缘关系较近。实体实验中，测序得到的两种黄粉蝶亚科物种斑缘豆粉蝶Colias erate、豆粉蝶Colias hyale 序列5’端200bp 在NJ（见图2）树上得到完全区分。

图2 基于38 个物种条形码构建系统发育树Figure 2 The Phylogenetic tree based of 38 species

在实验中，当被区分的序列的长度依次是648bp、200bp、50bp 的时候，其变异位点在0.913 7 与1 之间，简约位点的变动区间在0.897 1 到1 之间，种内差异为0.010-0.017，种间差别为0.152-0.191。以上这些数据基本上都可以用来表示微型DNA barcode 与完整的barcode 在遗传距离关系上起着相似的作用。所以微型DNA 条码类似于完整的DNA 条码，且根据分子进化生物学统计数据显示物种的种内差异在1%～2%之间，种间差异在10%～20%之间[7]，虚拟实验结果表明full-barcodeB 符合这个差异范围，即微型DNA 条码可以比较方便的去分辨物种。

但是由于目前微型DNA 条形码使用较少，可靠性还需要大量数据进行检验，在动物分类学中有一定的可靠性，但是在其他物种中会存在很多问题，这些问题需要我们去逐个发现并一一解决，从而使微型DNA 条形码能够作为一个可靠的标记基因进行物种鉴定。由于微型DNA 条码序列过短易受其他因素的影响，会使最后的结果产生偏离，且在使用微型DNA 条形码进行物种鉴定时还可能存在种间差异过大的问题，所以想要解决目前存在的问题，还需要科研人员进一步去分析解决。