含功效成分电子烟对动物模型止咳平喘作用研究

巩效伟，杨琰茗，张 霞，朱东来，翁稚颖，洪 鎏，韩 熠，赵 伟，罗义勇

(1. 云南中烟工业有限责任公司 技术中心，云南 昆明 650231； 2. 昆明医科大学，云南 昆明 650500；3 昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

0 引 言

电子烟是近些年来发展最为迅速的一种新型烟草制品，由烟杆(包括发光二极管、电池、控制电路、气动开关、雾化器等元件)和烟弹(包括贮液腔和吸嘴)组成，工作原理是通过电加热的方式加热含有包括烟碱在内的各种化学物质来产生烟雾，然后吸入口腔并通过肺部吸收.随着电子烟的发展，出现了具有功效的电子烟.早在2014年，阮艺斌等就公开了“一种具有止咳化痰功能的电子烟烟液”，该专利涉及一种止咳化痰电子烟烟液的配方及感官质量评价结果[1].2017年，左招霞公开了一件“止咳烟油与止咳电子烟”专利，涉及到止咳烟油配方及制备方法，并阐述了其功效[2].近期，王礼和也公开了“一种止咳烟油与止咳电子烟”专利，该专利涉及到止咳烟油配方、核心原料的制备方法，并简述了止咳电子烟对患有气管炎烟民的止咳、平喘效果[3].以上文献大多关于止咳电子烟烟液的配方及制备方法，对止咳功效的评价也仅限于感官质量评价或简单的人体试验.未见以动物模型为实验对象，对含功效成分的电子烟，开展止咳平喘的深入研究报道.

为了研究和验证功效物质在电子烟上的生物学评价，根据文献资料显示[4-9]和前期工作研究，选取了L-薄荷醇(清凉、抗炎)、L-茶氨酸(镇静安神)、丁香酚(抗菌、降血压)、木香烃内酯(利胆、消炎)、西贝碱(治疗肺热燥咳、干咳多痰)、菖蒲酮(开窍醒神、化湿和胃)、7, 4′-二羟基黄酮(改善血液循环、抑菌)、臭灵丹提取物(清热、解毒).将上述成分按照一定比例添加到电子烟烟液中，通过动物烟雾口鼻暴露系统(HRH-MNE)和单通道吸烟机(SM-120)，采用氨水引咳小鼠咳嗽模型和OVA引喘大鼠哮喘模型，对其进行烟气暴露后止咳平喘功效的评价.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

氨水(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20170301)；卵清蛋白(solarbio，批号：1127H054)；水合氯醛(青岛沙子口化工厂，产品批号：20100401)；多聚甲醛(天津市大茂化学试剂厂，产品批号：20141208)；氢氧化铝(西陇化工股份有限公司，分析纯)；NaOH(西安化学试剂厂，分析纯)；二甲苯(昆明医科大学药学院病理实验室提供)；HE染色所试剂(昆明医科大学药学院病理实验室提供)；L-薄荷醇(百灵威科技有限公司，纯度99.5%)、L-茶氨酸(百灵威科技有限公司，纯度≧99%)、丁香酚(百灵威科技有限公司，纯度98%)、木香烃内酯(云南西力生物技术股份有限公司，纯度≧90%)、西贝碱(云南西力生物技术股份有限公司，纯度≧70%)、菖蒲酮(云南西力生物技术股份有限公司，纯度≧50%)、7, 4′-二羟基黄酮(云南西力生物技术股份有限公司，纯度≧70%)、臭灵丹提取物(云南瑞升烟草技术(集团)有限公司提供).

1.2 仪器

烟弹(尺寸为φ9.2 mm×35.0 mm，电阻值为3.5 Ω)；电池杆(尺寸为φ9.2 mm×68.0 mm，电池容量为180 mA·h)(深圳合元科技有限公司)；烟弹与电池杆装配后的尺寸为φ9.2 mm×98.5 mm；HRH-MNE动物烟雾口鼻暴露系统(大小鼠)(北京慧荣和生物科技有限公司)；SM-120单通道吸烟机(北京慧荣和生物科技有限公司)；Nikon研究级正置荧光显微镜系统(上海千欣仪器有限公司)；手术器械(江苏苏科医疗器械有限公司)；flexiVent FX4震荡式动物肺功能系统(加拿大SCIREQ公司)；EMKA清醒式肺功能检测系统(北京广源达科技发展有限公司).

1.3 试验动物

SPF级别昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g，SPF级别昆明种大鼠，雄性，体重150～180 g，均由昆明医科大学实验动物中心提供，许可证SYXK(滇) 2005-0003.

1.4 方法

1.4.1 功效型电子烟止咳功效评价

1)小鼠分组.取筛选合格的小鼠100只，适应性喂养7天后称重标记，按体重随机分为：Control组(生理盐水雾化，生理盐水烟雾暴露)；Model组(10%氨水雾化致咳，含基础烟液的烟雾暴露)；试验组：L-薄荷醇组(10%氨水雾化致咳，含L-薄荷醇烟液的烟雾暴露)、L-茶氨酸组(10%氨水雾化致咳，含L-茶氨酸烟液的烟雾暴露)、丁香酚组(10%氨水雾化致咳，含丁香酚烟液的烟雾暴露)、木香烃内酯组(10%氨水雾化致咳，含木香烃内酯烟液的烟雾暴露)、西贝碱组(10%氨水雾化致咳，含西贝碱烟液的烟雾暴露)、菖蒲酮组(10%氨水雾化致咳，含菖蒲酮烟液的烟雾暴露)、7, 4′-二羟基黄酮组(10%氨水雾化致咳，含7, 4′-二羟基黄酮烟液的药物暴露)和臭灵丹提取物组(10%氨水雾化致咳，含臭灵丹提取物烟液的烟雾暴露)，共10组，每组10只小鼠.

2)小鼠咳嗽敏感性剔除实验.对所有小鼠进行咳嗽敏感性剔除实验：10%浓氨水喷雾20 s后，观察其3 min内的咳嗽次数和咳嗽潜伏期.小鼠的剔除标准如下：3 min内咳嗽次数少于10次或多于80次者；动物死亡、状态不佳、反应异常剧烈者.均为剔除对象[10].

3)小鼠烟气暴露参数优化.考虑到不同抽吸模式[11-12]并结合预实验结果，选取功效电子烟抽吸模式：20口/只/天，抽吸持续时间(2±0.1) s，抽吸频次(30±0.5) s，抽吸容量(55±0.3) mL，连续烟雾暴露1周；同时观察小鼠的生理情况及其耐受性等.

4)受试电子烟烟气吸入小鼠暴露实验.为保证暴露染毒过程中系统轻微负压，抽气流量一般设置要比气溶胶流量与稀释流量总和多，设定稀释流量为10 L/min，抽气流量为13.5 L/min，暴露期间氧浓度控制为(20.5±0.5)%，空气湿度控制为(80±5)%.使用SM-120单通道智能吸烟机，按照优化电子烟抽吸参数对小鼠进行连续1周的烟气口鼻暴露，每天1次.

5)对咳嗽小鼠模型的止咳功效评价.在第7天烟雾暴露结束1 h后，启动EMKA清醒式肺功能检测系统，在雾化泵中加入新鲜配置的10%氨水溶液.将小鼠放入EMKA清醒式肺功能检测系统配套的舱体中(舱体一端插入超声雾化器，另一端连接空气压缩机).将超声雾化器以最大喷雾力度(MAX)持续通入10%氨水喷雾20 s，立即关闭超声雾化器，使氨水雾化液自然扩散.在通入氨水雾化液的同时，用秒表计时，记录小鼠3 min内咳嗽次数(次)和咳嗽潜伏期(s).咳嗽的表现为：张大口或张小口时伴有咳嗽声，均可见腹肌收缩[13-14].

1.4.2 功效型电子烟平喘功效评价

1)大鼠分组.取筛选合格的大鼠100只，适应性喂养7天后称重标记，按体重随机分为：Control组(生理盐水注射致敏，生理盐水引喘，生理盐水进行烟雾暴露)；Model组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含基础烟液的烟雾暴露)；试验组：L-薄荷醇组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含L-薄荷醇烟液的烟雾暴露)、L-茶氨酸组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含L-茶氨酸烟液的烟雾暴露)、丁香酚组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含丁香酚烟液的烟雾暴露)、木香烃内酯组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含木香烃内酯烟液的烟雾暴露)、西贝碱组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含西贝碱烟液的烟雾暴露)、菖蒲酮组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含菖蒲酮烟液的烟雾暴露)、7, 4′-二羟基黄酮组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含7, 4′-二羟基黄酮烟液的烟雾暴露)和臭灵丹提取物组(10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体无菌原液致敏，10%OVA引喘，含臭灵丹提取物烟液的烟雾暴露)，共10组，每组10只大鼠.

2)大鼠烟气暴露参数优化.参考电子烟国际抽吸标准和加拿大深度抽吸标准[11-12]，结合试验电子烟，烟雾量情况以及预实验结果，最终确定：20口/只/天，抽吸持续时间(2±0.1) s，抽吸频次(30±0.5) s，抽吸容量(70±0.5) mL，连续烟雾暴露1周；同时观察大鼠的生理情况及其耐受性等.

3)哮喘大鼠模型的构建.分别于试验第1天和第8天分3点注射1 mL含10 mg OVA和100 mg氢氧化铝胶体的无菌抗原液(两侧腹股沟皮下注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL致敏)，于试验第15天时进行哮喘激发和烟雾暴露，哮喘激发连续3天，烟雾连续暴露7天.哮喘激发条件为：含10%OVA生理盐水雾化3 min，每天1次，Control组采用生理盐水雾化.当大鼠出现皮肤瘙痒，烦躁不安，点头呼吸，张口呼吸，明显腹式呼吸等症状，表明引喘成功；采用HRH-MNE动物烟雾口鼻暴露系统进行烟雾暴露.为保证暴露染毒过程中系统轻微负压，抽气流量一般设置要比气溶胶流量与稀释流量总和多，设定稀释流量为10 L/min，抽气流量为13.5 L/min，暴露期间氧浓度控制为(20.5±0.5)%，空气湿度控制为(80±5)%.使用单通道智能点烟机，20口/只/天，卷烟抽吸参数设置为：抽吸时间(2.0±0.1) s，抽吸频次(30.0±0.5) s，抽吸流量(70.0±0.5) mL.

4)哮喘模型大鼠的平喘效果评价.持续1周的功效型电子烟烟雾暴露结束后，对哮喘模型大鼠进行肺功能呼气指标测定，观察功效型电子烟对哮喘大鼠的影响.应用EMKA清醒式肺功能检测系统测大鼠肺功能情况，待动物在腔体内平静5～10 min趋于稳定且呼吸波平稳时开始记录数据，测定4个哮喘主要相关数据，包括呼气时间(Te)、最大呼气量(PEF)、呼气量(EV)、50%的呼气流速(EF50%).

5)肺组织病理学分析.处死试验动物，取出试验大鼠左肺放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h以上.

脱水透明：用由低浓度到高浓度的酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份；再将组织块置于透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精.

浸蜡包埋：将已透明的组织块放入已熔化的石蜡中，放入熔蜡箱保温.待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，包埋后方可进行切片、烤片操作.

HE染色制片：切片经环保脱蜡液脱蜡，酒精100%-95%-75%洗净环保脱蜡液至流水冲洗，然后过苏木素3～5 min，流水冲洗后入1%的盐酸酒精分化后水洗(洗掉多余未与细胞核结合的苏木素，目的是让核与浆分界明显)，1%氨水返蓝后水洗(苏木素与细胞核结合经碱反应后核与浆分界效果更明显)，放入伊红染色10～20 s，流水冲洗后放入75%-95%-100%酒精浓度低到高脱水，吹干后放入环保脱蜡液中透明，最后用中性树脂封片.显微镜下观察组织病理学变化.

1.4.3 实验数据的处理

采用Sigma Stat 3.5统计软件处理数据，各组数据单因素方差分析(One-Way ANOVA)，若方差不齐，则进行秩和检验.检验水准为0.05，采用Sigma Plot 10.0图形软件进行作图.左肺切片选取在显微镜下40倍的视野用OLYMPUS-BX51病理图像采集系统采集图片.图片用Image-Pro Plus17.0图像分析软件处理.

2 结果与讨论

2.1 功效型电子烟对咳嗽模型小鼠的影响

电子烟样品烟雾暴露1周后，与Control组比较，Model组咳嗽次数增加，但未达到显著性差异的水平，可能原因为小鼠对氨水刺激引咳的敏感性存在个体差异，受筛选入组小鼠样本量限制，所以得出这个结果，该结果也说明基础烟液对小鼠的咳嗽没有显著的不良影响；与Model组相比，L-薄荷醇、L-茶氨酸、丁香酚、木香烃内酯、西贝碱、菖蒲酮、7, 4′-二羟基黄酮7组和臭灵丹提取物组咳嗽模型小鼠咳嗽次数减少，其中木香烃内酯组效果最显著，存在统计学差异(P<0.05)；从咳嗽潜伏期来看，与Control组比较，Model组变化不明显，但与Model组相比，8种功效型电子烟暴露后均使咳嗽模型小鼠引咳潜伏期增长.结果见图1.

注：组间比较采用 one way analysis of variance；#: Model组vs试验组P<0.05图1 电子烟功效成分对咳嗽模型小鼠咳嗽次数(A)和引咳潜伏期(B)的影响Fig.1 Effects of functional e-cigarettes on cough model mice’ cough frequency (A) and incubation period (B)

咳嗽敏感性[15-16](cough reflex sensitivity)是指机体在接受外界刺激(包括化学、机械、温热)时，表现出来的咳嗽难易程度，它是咳嗽高敏感综合征的主要发病机制.本实验采用经典的氨水引咳方法，进行为期1周的功效型电子烟烟雾暴露，评价8种功效型电子烟烟雾对氨水引发的呼吸系统“咳嗽、喘息”的影响.止咳效果通过对咳嗽模型大鼠咳嗽次数和咳嗽潜伏期前后比较，评价8种成分的止咳效果.L-薄荷醇、L-茶氨酸、木香烃内酯、西贝碱、菖蒲酮和臭灵丹提取物6种成分不同程度减少了咳嗽模型小鼠的咳嗽次数并延长了咳嗽潜伏期，咳嗽模型小鼠对过敏原刺激耐受性提高，咳嗽反应敏感性下降，提示L-薄荷醇、L-茶氨酸、木香烃内酯、西贝碱、菖蒲酮和臭灵丹提取物6种功效型成分发挥了舒喉止咳的保健效果.

2.2 功效型电子烟对哮喘模型大鼠的肺功能影响

运用EMKA清醒式肺功能仪检测动物肺功能，与Control组比较，Model组大鼠Te延长、PEF、EF50%和EV下降，有统计学意义(P<0.05)，提示哮喘模型基本形成；与Model组比较，L-薄荷醇组哮喘模型大鼠的Te下降，EF50%增大，均存在统计学差异(P<0.05)；L-茶氨酸组哮喘模型大鼠Te下降，PEF和EF50%增大，均存在统计学差异(P<0.05)；丁香酚组哮喘模型大鼠PEF、EF50%和EV增大，存在统计学差异(P<0.05)；木香烃内酯组哮喘模型大鼠PEF和EV增大，存在统计学差异(P<0.05)；西贝碱组哮喘模型大鼠Te下降，PEF增大，存在统计学差异(P<0.05)；菖蒲酮组喘模型大鼠Te下降，PEF增大，存在统计学差异(P<0.05)；7, 4′-二羟基黄酮喘模型大鼠PEF和EV增大，存在统计学差异(P<0.05)；臭灵丹提取物组哮喘模型大鼠PEF和EF50%增大，存在统计学差异(P<0.05)，结果见图2.

注：组间比较采用 one way analysis of variance；*:Control组vs Model组P<0.05；#: Model组vs试验组P<0.05图2 功效型电子烟对哮喘模型大鼠Te(A)、PEF(B)、EF50%(C)和EV(D)的影响Fig.2 Effects of functional e-cigarettes on asthma model rats’ Te (A), PEF (B), EF50% (C) and EV (D)

过敏性哮喘[17-20](Allergic asthma)的特征为嗜酸性粒细胞浸润为主的气道炎症和气道高反应性，它是一种由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分共同参与的慢性气道炎症性疾病.其中，免疫-炎症反应是哮喘发病的重要机制，抗原通过抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)激活T细胞，活化的辅助性T细胞(主要是TH2细胞)产生白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13等进一步激活B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞及肺泡巨噬细胞等多种炎症细胞，造成气道炎症反应，过敏原通过APC激活T细胞是发生气道炎症的重要始动环节.哮喘发作时，表现为呼气性通气障碍.Te、PEF、EF50%和EV直观反映了呼气功能是否存在通气阻塞，是平喘效果评价的重要考察指标.

从大鼠清醒肺功能指标来看，薄荷醇、茶氨酸、木香烃内酯、丁香酚、西贝碱、菖蒲酮、黄酮和臭灵丹8种功效型电子烟对哮喘模型大鼠肺功能的指标均有不同程度改善：L-薄荷醇对Te、EF50%有显著改善；L-茶氨酸对Te、PEF和EF50%有显著改善；丁香酚对PEF、EF50%和EV有显著改善；木香烃内酯对PEF和EV有显著改善；西贝碱对Te、PEF有显著改善；菖蒲酮对Te、PEF有显著改善；7, 4′-二羟基黄酮对PEF和EV有显著改善；臭灵丹对PEF和EF50%有显著改善；其中对肺功能L-茶氨酸和丁香酚呼气指标的综合疗效显著.

2.3 哮喘模型大鼠肺组织病理切片

取材动物肺组织肉眼观察：取材动物肺组织时，对比Control组，观察Model组大鼠肺组织呈暗红色，存在明显肿胀，L-薄荷醇组、L-茶氨酸组、丁香酚组、木香烃内酯组、西贝碱组、菖蒲酮组、7, 4′-二羟基黄酮组和臭灵丹提取物组存在轻微肿胀.

肺组织显微镜观察：Model组可见明显的哮喘病理改变(见图3B)：支气管内有黏稠痰液，支气管壁增厚，黏膜肿胀充血，平滑肌肥大，基底膜增厚并发生玻璃样变；L-薄荷醇组、L-茶氨酸组、丁香酚组、木香烃内酯组、西贝碱组、菖蒲酮组、7, 4′-二羟基黄酮组和臭灵丹提取物组与Model组相比，黏膜水肿程度减轻，但仍存在一定炎症：单核细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润，黏液中可见少量菱状Charcot-Leyden晶体(嗜酸性粒细胞崩解产物).肺组织病理切片结果见图3(40倍视野).

注：在B图中，红色箭头示“支气管黏膜上皮杯状细胞增多、平滑肌肥大、基底膜增厚并发生玻璃样变”，黑色箭头示“支气管黏膜固有层、下层和肌层有单核细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润”，绿色箭头示“支气管腔内见黏液栓其中可见夏克莱登结晶”A: Control组；B: Model组；C: L-薄荷醇组；D: L-茶氨酸组；E: 丁香酚组；F: 木香烃内酯组；G: 西贝碱组；H: 菖蒲酮组；I: 7,4′-二羟基黄酮组；J: 臭灵丹提取物组图3 哮喘模型大鼠肺组织病理切片Fig.3 Pathological sections of lung tissue on asthma model rats：A. control group; B. model group; C.L-menthol group; D.L-theanine group; E. eugenol group; F. costunolide group; G. sipeimine group; H. Shyobunone group; I.7, 4′-dihydroxy flavonoids group; J. Laggera pterodonta extract group

通过哮喘模型大鼠的肺组织病理学发现：Model组显微镜下能观察到明显哮喘病理改变，大鼠肺基底膜增厚并发生玻璃样变，支气管内有黏稠痰液，支气管壁增厚，黏膜肿胀充血，提示基础烟液烟雾暴露会导致支气管炎症；进行功效型电子烟烟雾暴露后，哮喘模型组大鼠哮喘减轻，支气管内量炎性因子减少，黏膜肿胀充血缓解，提示8种添加成分具有一定抗炎效果，能不同程度缓解烟雾暴露带来的支气管炎症.

3 结 论

通过开展含不同功效电子烟对动物模型的止咳平喘实验研究，表明在电子烟烟液中添加L-薄荷醇、L-茶氨酸、丁香酚、木香烃内酯、西贝碱、菖蒲酮、7, 4′-二羟基黄酮和臭灵丹成分能提高机体对过敏原刺激耐受性，使咳嗽反应敏感性下降，达到了舒喉止咳的保健效果，其中木香烃内酯效果最佳；添加L-薄荷醇、L-茶氨酸、丁香酚、木香烃内酯、西贝碱、菖蒲酮、7, 4′-二羟基黄酮和臭灵丹提取物对哮喘模型大鼠肺功能各指标改善情况各有优势，其中L-茶氨酸和丁香酚综合疗效显著，明显改善了哮喘的呼气障碍.