基于微区XRF技术的海洋生物元素快速无损检测

林梵宇，尹希杰*，郑新庆 ，黄杰超，梁毓娜

(1.自然资源部 第三海洋研究所,福建 厦门 361005；2.福建省海洋生态保护与修复重点实验室,福建 厦门 361005；3.自然资源部 海峡西岸海岛海岸带生态系统野外科学观测研究站,福建 厦门 361005)

金属元素在不同的海洋生物之间的分布常常表现出差异化富集的特点,一般常见的金属元素在双壳类生物中的含量最高,其次是头足类或虾蟹类,鱼类中含量最低[1-2],且底层鱼类的金属元素富集能力总体来说大于中上层鱼类[3]。这种差异主要由生物的摄食习惯、环境偏好和食物链层级的差异性导致。此外,生物不同器官中的金属元素分布往往也存在差异,其分布特点可指示海洋生物的生理过程和代谢途径。例如双壳贝类体内的金属硫蛋白可以结合多种金属元素,从而造成强富集效果,指示了体内参与硫蛋白结合机制的相应位置[4]。不同元素在鱼类内脏和鳞片中的含量差异特征与金属元素进入鱼体的途径有关,通过摄食途径进入体内的元素多在内脏中累积,而通过体表或黏膜渗透途径进入体内的元素则在鳞片和鳃中含量较高,而肌肉中含量则相对较低[5]。

由于海洋生物对环境重金属元素具有积累作用,其含量可用于揭示其周边环境的变化过程。随着海洋环境污染日益严重,很多海洋无脊椎动物已被作为重金属污染的指示生物[6]。如毕士川等[7]在不同季节调查同种水产品的铅(Pb)含量时发现,随着雨季来临,污染物进入水体造成贝类和头足类中Pb含量比其他季节偏高；史可江等[8]在对工业区下游等水域的生物进行重金属含量检测时,常常可检测出镉(Cd)、Pb等含量不同程度的超标；姜可磊等[9]对湖相沉积物中介形类壳体的镁(Mg)、锶(Sr)和钙(Ca)的含量进行分析,发现其比值关系可以反映生存环境温度、碱度及季节变化的相关信息；李志良等[10]对Pb、Cd、Zn、锰(Mn)和铜(Cu)五种重金属元素分别在铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)的壳、内脏团及外套膜等不同部位富集程度进行研究,可作为指示湘江水体生态系统重金属污染的生态风险评估指标。

近年来高分辨、原位和无损检测生物体中元素分布技术成为相关领域关注的热点,其主要包括微区XRF技术、电镜能谱联用技术、激光剥蚀电感耦合等离子体质谱技术、同步辐射技术及激光诱导击穿光谱技术等。冯流星和王军[11]通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱技术对山羊脑和牛肝组织切片标准样品中的铁(Fe)进行了定量检测；袁静和罗立强[12]通过同步辐射技术研究了蚯蚓样品中毒性元素的富集作用；万雄等[13]通过激光诱导击穿光谱技术研究重金属污染的鱼体内Pb、钡(Ba)等毒性元素的含量及分布特点等。微区XRF技术此前多应用于矿物、岩石类样品的元素微区分布特征研究领域[14],国外研究者尝试将该技术应用于植物样品的检测并获得良好的结果[15],但该技术鲜有用于海洋生物检测的报道。由于该技术对样品表面的平整度没有太高的要求,检测属于原位无损分析,前处理过程简单,可一次性获得多种无机元素信息,最重要的是和其他技术相比,能够获得相对较大样品元素的分布信息,因此特别适合不同大小、不同类型和形状海洋生物样品表面元素的分布测定。本研究尝试将微区XRF技术应用于多种不同类型的海洋生物样品元素分布测试,证明该技术可针对不同种类生物的体表层元素分布特点进行可视化展示,为后续该技术在调查海洋样品元素分布方面的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

本研究使用的主要仪器为微区X 射线荧光分析仪(Ixrfsystems公司,型号ATLAS),采用了10μm 光斑的聚束毛细管X 射线透镜作为激发源。

1.2 样品类型及预处理

采集鱼、虾、双壳贝类和海胆外壳四种样品,具体为六带拟唇鱼(Pseudocheilinus hexataenia)、假绵羊虾(Saron rectirostris)、无鳞砗磲(Tridacna derasa)和高腰海胆(Mespilia globulus)。其中,无鳞砗磲取自中国科学院南海海洋研究所海南热带海洋生物实验站养殖的砗磲幼贝自然死亡个体；鱼、虾和海胆样品均采购自厦门市内观赏水族市场,样品自然死亡后,利用自来水和双蒸水对其进行简单清洗,并置于60 ℃烘箱中2～3 d待水分烘干。烘干后采用微区X 射线荧光分析仪进行样品表面元素的检测。

1.3 实验方法与数据处理

1.3.1 微区XRF扫描及分析步骤

将干燥的样品固定于样品台上,由于生物类样品略不平整,所以调整样品与X射线探头的距离,使样品大部分位于合适焦距的位置。面扫时,X射线功率设置为50 keV,检测器频率(Tc)＝1.0μs,单点扫描步长根据样品面积大小调整,对于六带拟唇鱼、假绵羊虾、无鳞砗磲和高腰海胆样品,扫描步长分别为22、22、23和21μm,单点驻留时间设置为30 ms。扫描完成后,对能谱信号进行元素组成的谱图解析。针对样品单点扫描的平行性研究,选择了六带拟唇鱼样品背部、无鳞砗磲外壳近接合处及无鳞砗磲外壳边缘处的随机单点,分别进行5次单点扫描分析,点驻留时间200 s,检测器频率(Tc)＝1.0μs。扫描完成后,对5次单点扫描的平行性进行均值分析、标准偏差(Standard Deviation,STD)分析、相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分析。

1.3.2 数据导出与后处理

微区XRF设备自带软件可生成多种格式类型的数据。一方面,软件根据能谱解析的各种元素种类及信号强度值进行归一化处理,得到不同元素的分布图,分布图中不同的颜色分别代表不同的元素,颜色越深则表示该元素在某位置的信号强度越强。软件还可以在简单的参数设定后对不同元素图像进行叠加处理,在同一副画面中以不同颜色表示不同元素,同时展示多种元素的分布特点,从而更加便于观察元素分布情况的正负相关性。另一方面,如需获得热图、色差图等图像,或对数据进行深度处理(例如不同元素的比例等),则需要将数据导出至外部软件进行加工。将检测获得的元素信号强度值存为txt文件制成excel表格并导入Originlab公司的制图软件Origin 7.0中,在制图软件中调整合适的坐标参数使图像能清晰反映元素分布细节信息。

2 结果与分析

2.1 虾类样品

对烘干后的假绵羊虾样品进行了面扫分析。结果显示,在假绵羊虾样品中,元素表面分布特征在样品不同器官位置存在差异性:氯(Cl)、钾(K)和硫(S)等主要分布在虾眼部、头部的肝胰腺及腹部等部分附肢中；Ca、Cd、Sr和磷(P)等在整个虾壳体表层则分布比较均匀；而在Cl、K和S等元素含量高的器官体表位置,Ca、Cd、Sr和P的含量则相对较低(图1)。选取Ca和Cl两个元素作为代表进行分布图叠加,可以清晰见到选取元素分布在上述位置的差异。进一步对Ca与Cl信号强度比值进行热力图成像,同样验证了元素分布上存在差异(图1)。

图1 假绵羊虾中部分元素的分布特征及Ca与Cl元素的相关性分析Fig.1 Distribution characteristics of some elements in Saron rectirostris and correlation analysis of Ca and Cl

2.2 鱼类样品

对烘干后的六带拟唇鱼样品进行面扫分析。结果显示,P比较均匀地分布在鱼的鳞片上,在没有鳞片的头部前段含量很低；K 在鱼腹部和背部含量较高,S在鱼背部的含量较低,进一步对鱼身从腹部到背部的线扫描分析发现,K 和S含量在鱼身的大部分区域含量高低趋势是完全一致的,但从鱼侧线到背部顶端的区域,2种元素的含量高低呈现完全相反的趋势；Cl的分布特点与S有一定的相似性,但在鱼尾部和头部的部分区域明显存在很高的含量；Fe在鱼体中呈不规律的点状分布；Zn在鱼背部腹部含量稍高,在鱼眼中的含量最高(图2)。

图2 六带拟唇鱼中部分元素的分布特征及K 与S元素的相关性分析Fig.2 Distribution characteristics of some elements in Pseudocheilinus hexataenia and correlation analysis of K and S

2.3 双壳贝类样品

对双壳贝类样品无鳞砗磲进行微区面扫分析,结果显示,双壳贝类样品与虾类样品具相似的特征,即Ca与Cl含量叠加互补分布。对2种元素的叠加图分析可知(图3),在无鳞砗磲样品边缘区域,Ca信号强度值大大超过Cl,而Cl则在无鳞砗磲主体部分呈点状分布,其分布区域正好与Ca互补。进一步对Ca和Cl信号强度值的相关性进行点图分析发现,2种元素相关性特征主要分为两簇点群,一部分在Cl含量极低的区域,主要在无鳞砗磲的周边部分,Ca含量从低到高均匀分布；其余部分Cl和Ca的含量呈负相关关系。除此2种元素之外,还可发现K 和硅(Si)在无鳞砗磲上点状分布,P在无鳞砗磲除脊线以外的部分均匀分布,Al在无鳞砗磲除脊线以外的部分呈现点状分布特征,而脊线的部分S含量较高(图3)。

图3 无鳞砗磲中部分元素的分布特征及Ca与Cl元素的相关性分析Fig.3 Distribution characteristics of some elements in Tridacna derasa and correlation analysis of Ca and Cl

2.4 海胆外壳

对高腰海胆外壳样品进行了面扫分析。结果显示,K、Cu、Fe、Mn和钛(Ti)沿海胆外壳环向不同的区域分布；P、Ca、Cl和铝(Al)则沿纵向不同区域分布,其中Cl的含量高低与P和Ca等元素存在互补特性；S主要分布在疣突区域,与其他元素反向互补；Si含量极低,呈零星点状分布(图4)。

图4 高腰海胆中部分元素的分布特征Fig.4 Distribution characteristics of some elements in Mespilia globulus

2.5 单点扫描及数据平行性分析

为验证设备的稳定性,对六带拟唇鱼样品背部、无鳞砗磲外壳近接合处及无鳞砗磲外壳边缘处分别选取了随机单点,各进行5次单点扫描分析。结果可见,对于大部分元素而言,5次扫描半定量值的相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)在8.2%以内,相对标准偏差较小。对于少量含量特别低的元素,如六带拟唇鱼样品背部的Si、Cr和Cu以及无鳞砗磲外壳边缘处的P 等,由于信号值很低,其半定量值均在0.25%以下,所以相对标准偏差较大,约为13.6%～26.5%(表1)。由于能谱设备属于半定量检测设备,因此,在不存在标样及样品基质背景复杂的情况下,多次点扫描证实了样品检测的各元素平行性大体良好,可以真实反映元素在样品中的分布特征。

表1 微区XRF的平行性验证Table 1 Parallelism verification of micro-XRF detection

3 讨论

微区XRF技术已应用于地质和植物样品元素分布特征研究。在陆缘沉积物钻取岩芯制成的地质薄片样品中,该技术用于测试与古气候和古环境相关的示踪性元素分布,利用元素分布特征研究沉积物质来源,推测其成岩演化过程[16]。在矿物鉴定领域,微区XRF 技术用于指示铅锌矿和闪锌矿中异常元素的分布特点,从而用于区分方铅矿和闪锌矿等类质同相矿物,提高铅锌类矿物鉴定的准确性[17]。2017年罗立强等[18]将该技术应用于植物对毒性元素的耐受机制研究,分析了生物膜间的元素迁移情况和玉米(Zea mays)种子发芽过程中的元素分布特征。2020年Harvey等[19]将植物中的特征元素硒(Se)作为指标,结合微区XRF技术及液相质谱技术等方法,研究其分布特征及存在形式,从而证实老叶到新叶的元素传输路径。

本研究通过微区XRF技术对海洋生物样品的体表元素分布进行了检测。在扫描过程中,根据样品基质不同,微区XRF设备对样品的检测深度存在差异。在X 射线波长不变的情况下,其穿透深度与样品的质量吸收系数及密度有关,即样品的平均原子序数越小(轻元素含量高),穿透深度越大。由于基质的复杂性,其具体穿透深度无法准确确定。如果是硬质外壳类型,如海胆外壳或砗磲,X 射线的穿透深度通常在几十微米到200μm；如果是鱼虾等样品,穿透深度可达100μm 到几百微米[20]。在扫描后的数据解析过程中,由于目前常规能谱检测器无法完全分辨能级位置非常接近的谱峰,正确的谱图解析对准确获得元素种类十分重要。在实际分析中,判断能谱峰是否真实可靠的主要方法包括:①谱峰形态是否明显呈现高斯正态分布特征,形态分布不规则的谱峰往往需要重新检查是否存在合峰或逃逸峰的干扰；②同种元素不同谱线的高度是否异常,对于同种元素的不同谱线之间应当存在信号强度值的相关性,体现在谱峰高度之间存在适当的比例关系。以本研究的假绵羊虾样品中Cd元素的解析为例,由于生物样品表面K 含量很高,因此Cd-Lβ能谱峰(3.317 ke V)与K-Kα能谱峰(3.314 ke V)无法完全分离,且K-Kα能谱峰尾对响应值较低而位置接近的Cd-Lα能谱峰(3.134 ke V)带来巨大干扰。在Cd-Lα与Cd-Lβ能谱峰受到干扰的情况下,为判断Cd是否真实存在,选取受干扰较小的Cd-Kα能谱峰(23.174 ke V)进行分析并最终成图。

在对海洋生物样品的元素分布研究上,微区XRF技术存在自身的优缺点。X 射线作为激发源确保了检测过程的原位及无损。能谱检测器的特性决定了该技术可同时对样品表面大多数元素的分布特征成像。本研究表明,该技术对样品前处理的要求很低,只需简单的清洗烘干即可,且可检测的样品表面积较大,样品表面不需经过特定的平整化处理,尽可能保持了样品的原貌。这有利于表面平整度不高、表面积相对较大的海洋生物样品快速检测。当然,该技术也存在一定的缺陷,由于X 射线激发源对低原子序数元素的过高穿透性和对高原子序数元素无法激发[20],在检测这2类元素时难以产生足够强度的信号,因此该技术难以分析原子序数过低或过高的元素。而生物样品中有机元素的含量通常较高,本文中各类生物样品的检测中,难以获得低原子序数的碳(C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)等元素信号。此外,能谱检测器的检出限较高,在分析样品中含量特别低的元素时也存在困难。例如,将本研究中的假绵羊虾样品进行纵切面后尝试对其内脏器官表面Hg的分布情况进行检测,由于Hg含量低于能谱检测器的检出限,未能获得与背景存在显著差异的Hg信号。该技术属于半定量技术,无法对于样品中的元素含量进行精确定量。先前针对其他样品的研究表明,在仅需要对较小面积的样品中低含量元素或低原子序数元素的分布特点进行检测时,可采用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱联用技术[21]以获得较精确的定量信息,采用LIBS技术[22]或同步辐射技术[23]研究低原子序数元素的分布情况。

经过对海洋生物体样品体表的微区扫描发现,元素在不同生物体表层的富集器官是存在明显差异的,这有助于研究者将该技术应用于探讨重金属元素如何在生物体表层富集的潜在可能性。在六带拟唇鱼样品的线扫描研究中,K 与S的分布在侧线到腹部的位置呈现完全的正相关性,而在侧线向背部的部分则呈现负相关性,这一特点暗示着侧线为分界线的表层元素分布特征差异性,有助于研究者对其原因进行进一步深入探索。在假绵羊虾、无鳞砗磲和高腰海胆外壳中均发现Ca和Cl的分布互补性,这可能与海水中氯离子(Cl－)在不同表面的沉积情况有关,在富含钙质的壳体表面Cl不易富集,其真实原因尚待进一步的实验证实。如果将元素分布特征与环境变化特征进行比较,将对生物生长过程中的环境改变具有启示作用。例如在假绵羊虾样品中,本研究得到了Ca和Sr的分布特征,而锶钙比在多种水生生物中被证明是与环境中的盐度、温度等因素及生物摄食情况密切相关的[24-25]。此外,砗磲外壳体具有年纹层,其分层特点包含形成时的气候环境信息,是一种分辨率较好的古气候研究载体。由于砗磲外壳体中主要成分为碳酸钙(CaCO3),含量在90%以上[26],检测其他低含量元素的分布特点常常存在困难,而通过本实验室高灵敏度检测器的微区XRF设备可以获得砗磲外壳表层多种不同元素的差异性分布特征,为研究者在后续进一步探讨环境特征的相关性提供依据。海胆外壳同样是以Ca为主体,本研究发现其Fe、Mn、Cu和K 等多种元素在外壳不同圈层分布的特征,同样将为环境变化情况提供参考指标。

4 结论

本研究利用微区XRF技术对鱼、虾、砗磲、海胆外壳等海洋生物样品进行了微区面扫描,将扫描获得元素数据进一步进行分析和可视化处理,并对样品表面的不同元素相关性进行了分析,得到结论如下:

①该技术适用于上述海洋生物样品的检测,可获得样品表面元素的微区分布特征；

②在此技术基础上,辅助以线性扫描等补充测试方案,可进一步佐证其面扫结果可信度,并获得不同元素在样品中特定线性区域上的差异性对比；

③通过多次单点扫描得到多组重复元素含量数据,证实测试结果平行性良好,表明样品体表元素分布数据稳定可靠。

研究结果表明,微区XRF技术在测试不同类型海洋生物样无机元素分布特征方面具有明显的技术优势。一方面,该技术适用于大面积的样品检测,可全方位整体展示样品表面元素微区特征。另一方面,该技术前处理方案简单,可操作性高,对于相对脆弱的生物样品可尽量保持其原位特点。此外,在数据处理方面,本研究通过线扫描、元素比例分析等多种方式,展现了该技术在实际研究中分析样品特定区域元素微区特征或多种元素之间相关性特点的可行性。