丹参注射液对神经病理痛大鼠DRG神经元P2X3受体的影响

张晓丹

神经病理痛已经被认定为慢性疾病,其发生与神经元、神经胶质细胞等的作用影响有关,因此,在临床中很难被治愈。丹参的药理活性体现在改善脑缺血再灌注损伤、血小板功能、血液流变学等方面,有镇痛效果的可能性［1］。本研究分析丹参注射液对CII 大鼠P2X3 受体表达的影响,报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取由某医学院实验动物中心提供的SD 大鼠18 只,均已成年,雄性,将其在室温下进行饲养,不限制饮食。取250 g±25 g SD 雄性大鼠随机分为对照组、CCI 模型组、CCI+丹参注射液组,每组6 只。

1.2 研究方法 ①建立CCI 大鼠动物模型：随机将大鼠分为对照组进行假手术,CCI 模型组与SF+CCI 模型组均建立疼痛模型,SF+CCI 模型组单独进行丹参注射液治疗。②动物行为学方法：观察丹参注射液对CCI 大鼠痛觉行为的影响(测定痛阈)：测定各组动物机械剌激及热剌激痛觉过敏现象。③免疫组织化学反应：先用兔抗P2X3(1∶500,CHEMICON International,Inc.)及生物素标记羊抗兔IgG 二抗血清(P2X3 和p38,1∶200,Vector,Burlingame)分别进行抗生物素-生物素-辣根过氧化酶(ABC)免疫组化法反应,DAB 呈色。然后进行免疫细胞化学P2X3 和p38 双重标记染色观察。采用Image-Pro Plus 图像分析系统对免疫组化反应结果的反应密度进行观察并予以分析。对所有组别大鼠背根神经节免疫组化反应结果进行对比分析。④原位核酸分子杂交试验：用地高辛标记的P2X3 和p38 寡核苷酸探针对各组大鼠背根神经节标本进行原位杂交。⑤逆转录(RT)-PCR 检测：分别提取各组大鼠背根神经节标本总RNA 进行RT-PCR 检测,PCR 产物经琼脂糖凝胶电［2］。⑥Western blot 分析：分别提取各组大鼠背根神经节标本蛋白,电泳样品分离后转移到硝酸纤维素膜上,用兔抗P2X3 和p38(1∶500,CHEMICON International,Inc.)及生物素标记羊抗兔IgG 二抗血清(P2X3 和p38,1∶200,Vector,Burlingame)进行抗生物素-生物素-辣根过氧化酶(ABC)反应,进行半定量统计分析。

1.3 细胞面积测量以及数量统计 采用系统随机抽样法,在对照组和CCI 模型组、CCI+丹参注射液组的DRG 标本中进行片子挑选,每组挑选30 张,将OLYMPUS 显微镜的视野调节至适当水平,将挑出的组织切片置于该显微镜下收集阴性及阳性神经元,收集过程中需进行拍照,各50 张,同时利用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理图文分析系统,该系统中的面积测定功能可以完成对免疫阳性细胞、免疫阴性细胞面积的测定,分别计算对照组和CCI 模型组、CCI+丹参注射液组大鼠免疫阳性细胞的占比,按照百分比来计算,对各个区间内免疫阳性细胞面积的数量进行统计,对不同区间内免疫阳性细胞在总细胞中的占比进行计算［3］。

1.4 主要实验仪器 倒置显微镜 (Olympus,日本)1台；超净工作台(国产)1 台；分析天平 (国产)1 台；电热恒温干燥箱(国产)1 台；电热恒温水浴箱(国产)1 台；隔水孵箱(国产)1 台；低温冰柜(国产)1 台；高压蒸汽灭菌器(国产)1 台；电子天平(国产)1 台；德国艾本德公司生产的低温超速离心机和分光光度计各1 台；Thermomixer(Eppendorf 公司)1 台；电泳仪(Bio-Rad 公司)1 台；垂直式电泳槽(Bio-Rad 公司)1 台；硝酸纤维素膜电转系统(Bio-Rad 公司)1 台；凝胶成像系统。

2 结果

2.1 正常大鼠DRG P2X3 受体表达 对照组中的所有大鼠背根神经节处存在感觉神经元细胞,其属于P2X3受体免疫阳性反应,细胞被染色,呈现为深蓝色,胞浆的标记的关键处,胞核未被染色。免疫阴性反映中的感觉神经元细胞染色不深,强度有所不同。P2X3 受体免疫阳性反应细胞大部分为小细胞,在总细胞数中所占比例达到31.6%。对细胞面积进行测量,并统计其数量后,P2X3 受体免疫阳性反应细胞面积的平均值达到(344.03±10.59)μm2。

2.2 各组术前术后的疼痛程度比较 术后1～24 d,SF+CCI 组疼痛程度均低于CCI 组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组术前术后的疼痛程度比较()

表1 各组术前术后的疼痛程度比较()

注：与SF+CCI 组比较,aP<0.05

2.3 免疫组化检测DRG 神经元P2X3 免疫反应 P2X3受体的表达在CCI+SF 组为(173.81±2.96),低于CCI 组的(282.31±2.69),差异有统计学意义(t=66.447,P<0.05)。

3 讨论

慢性炎症痛很容易引发痛过敏、触诱发痛等,但是具体的发生机制尚不明确,需要进一步进行研究。大量研究表示,C 纤维以及Aδ 纤维会受到外周炎症的影响,兴奋度会有所增强［4］。C 传入纤维紧密联系于P2X3 表达小细胞。背根节小细胞存在P2X3 表达,小细胞的占比较高,其属于具有伤害性的感受器,说明腺嘌呤核苷三磷酸发生伤害性感受器激活时,腺嘌呤核苷三磷酸发挥了介导作用。其他相关研究也指出,发生面部慢性炎症痛后,P2X3 表达的小细胞面积平均值有所增加,大细胞比例也有所上升。有研究结果显示,对照组大鼠的P2X3 受体表达分布依然以中小型细胞为主［5］。

为发生异常的情况下,感觉神经节中的大细胞与中枢神经系统进行触觉刺激传送时,主要是经由AB 纤维来完成的。大量研究证实,炎症痛影响了AB 纤维的化学表型使其发生了变化,与此同时,在无异常情况发生时,背根神经节细胞可以选择是否表达P 物质。

三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)是重要能量物质。大部分学者表示,ATP 是作为递质存在于外周与中枢神经系统之间。以腺苷和ATP 的选择亲和力为依据,对“嘌呤受体”进行区分,共有两大类型,即P1 受体和P2 受体。P2X 受体归属于离子通道受体家族,所包含的氨基酸有379～595 个,跨膜结构域2 个,保守序列以胞外环结构为集中位置。翻译后修饰有两类,即糖基化和磷酸化。现如今,应用分子克隆技术对哺乳动物P2X 受体亚单位进行克隆,已经成功获得7 个。ATP 刺激细胞兴奋性被P2X 受体激活后,兴奋性氨基酸得以大量释放,伤害感受性反映被激发,出现细胞凋亡。功能性P2X 受体近似与配体门控离子通道,其组成结构中包含大量的亚单位组合。在P2X 受体中,P2X2/3、P2X3、P2X4、P2X7 受体均与神经病理痛有密切联系。P2X3 受体在表达背根神经节、结状神经节、三叉神经节等初级传入感觉神经时具有一定的选择性,主要包括中小型神经节细胞［6］。P2X 受体与神经病理痛有密切关联,其中以P2X2/3、P2X3 受体为主。DRG 胞体P2X3 受体被交感神经所释放出的ATP激活后,在神经病理痛中发挥影响,ATP 的释放可以协同神经肽和去甲肾上腺素,DRG 感觉神经元因此被激活进而产生疼痛感。初级传入感觉神经元被P2X3 受体表达时,植物凝集素B4(IB4)、瞬时感受器电位香草酸受体1 (TRPV1)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)或P 物质也可能会参与其中,表示该受体会影响痛信息处理。机体所感受到的疼痛程度受到P2X3 受体的影响,其表达上调或者活性增强均可能让痛感加剧,反之则痛感得到缓解。目前,关于疼痛的治疗研究更加偏向于P2X3 受体功能与数量的调节机制类型、P2X3 受体表达下降或者脱敏的方法等［7］。相关研究结果发现,P2X3 受体激动剂的内向电流受到前列腺素E2(PGE2)、神经生长因子 (NGF)、P 物质和谷氨酸等的影响会有所增强,P2X3 受体功能因此可在短时间内迅速上调。传入神经活化和炎症反应经P2X 受体作为介导,受到癌症痛和慢性神经病理痛的影响。P2X3 受体克隆取得成功后,其功能性在背根神经节被发现,这一发现为首例,经深入研究后发现,P2X3 受体表达仅局限于初级感觉神经元,尤其是小直径背根神经节,其对伤害性感受尤为明显。在背根神经节中,P2X 受体受到ATP的影响,与神经病理痛的发生、感觉信息传递等密切相关。出现神经病理痛的情况下,在背根神经节中,P2X3 受体mRNA 和蛋白表达明显增强［8］。从实验结果可以看出,P2X3 受体与神经病理性疼痛存在紧密的联系,在预防和治疗神经病理痛时可作为靶点。所以,特异性的P2X3 受体阻断剂可应用于预防和治疗神经病理痛。

丹参属于唇形科,是一种科鼠尾草植物,在活血化瘀的中药材中应用率较高,在《神农本草经》中首次被记载,并认为其属于草部上品。丹参味道微苦,属寒性,其主要功效包括活血化瘀、调经止痛、养血安神、清心去燥等。古人认为,丹参的功效可抵当归、地黄、芍药、川穹,其具备当归补血生血、芍药调血敛血、川穹生新祛瘀的功效。丹参之所以可以起到活血祛瘀的作用,主要是因为其有养血功效。丹参是一种传统中药材,同时也在现代医学研究中占据重要地位。其由多种化学成分组成,主要包括水溶性酚酸类化合物、脂溶性二萜醌类化合物。近些年,有研究指出,在治疗脑缺血再灌注损伤、血小板功能缺失、血液流变学异常等方面,丹参的药理活性较为理想。通过清除、减少自由基产生,抑制过氧化反应、抗炎症介质,调节氨基酸类神经递质保护神经元,抑制凋亡细胞等实现药理活性。由此提示丹参可能具有镇痛作用。

综上所述,丹参注射液可抑制CII 大鼠P2X3 受体的表达,对外周神经疼痛的缓解作用主要通过免疫抑制剂抗炎效果来实现。