白果蒲桃组织培养技术

陈 春

(福建省林业科技试验中心，福建 南靖 363600)

白果蒲桃(SyzygiumalbumQ.F.Zheng)为桃金娘科蒲桃属常绿乔木[1-2]，属极濒危物种，仅福建省云霄县下河镇梅林村发现1株树龄约220年的野生大树[3]，其他地区未见报道[4-6]。白果蒲桃树干红褐色，嫩梢呈现不同色彩，具有较高的观赏价值,可作为观赏树及行道树[7-10]。由于白果蒲桃种群数量极为稀少，分布范围狭小且繁育困难，若不加以保护，将导致物种灭绝[3]。目前，白果蒲桃主要采用扦插繁殖，但幼苗的移栽成活率较低[7]。因此，开展白果蒲桃无菌播种及组织培养试验，扩大种群规模，是当前迫在眉睫的工作。

利用无菌播种繁殖白果蒲桃，可克服人工播种时萌芽率极低的难题[2]，提高种子萌发率，缩短育苗周期[6]。目前，国内外尚无关于白果蒲桃无菌播种及组织培养的报道。因此，本研究以白果蒲桃种子为供试材料，通过优化组织培养(包括无菌体系建立、种子萌发诱导、不定芽增殖及生根培养等)，建立白果蒲桃组织培养技术体系，以期为其优良品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为福建省林业科技试验中心种质资源圃采摘的白果蒲桃扦插苗成熟种子。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌体系的建立 2020年1月，选择种质饱满且成熟度高的白果蒲桃种子,用稀释过的洗衣粉溶液浸泡15 min，置于自来水下冲洗15 min；再用0.1%灭菌净溶液浸泡10 min，自来水震荡冲洗2遍后置于超净工作台。种子用体积分数为75%的酒精溶液消毒1 min，无菌水冲洗3遍；再分别用质量比为0.1%的HgCl2消毒20、25、30 、35 min，无菌水冲洗3遍。将剥掉种皮的种子接种到萌发培养基。每个培养瓶接种1粒种子，每个处理接种10瓶，重复3次。培养15 d后统计污染率和死亡率。污染率/%=(污染的种子个数/接种的种子总数)×100；死亡率/%=(死亡的种子个数/接种的种子总数)×100。

1.2.2 种子萌发培养基的筛选 将消毒后的种子接种到不同的萌发培养基中。前期预试验发现，添加0.2 g·L-1活性炭和0.4 g·L-1蛋白胨有利于白果蒲桃种子的萌发。因此，共设计7组不同质量浓度活性炭和蛋白胨组合的萌发培养基。每个处理接入 10粒种子，重复3次。培养15～30 d后，对萌发的种子进行编号，同时观察并记录种子的萌发天数、萌发率及芽苗生长情况。萌发率/%=(萌发的种子个数/接种的种子总数)×100。

1.2.3 不定芽诱导培养基的筛选 以无菌白果蒲桃实生苗为材料，采用L9(34)正交试验设计培养基组合(表1)。切下无菌种子苗的茎段和顶芽，接种到不定芽诱导培养基中培养，每个组合接种30个茎段或顶芽，重复3次。暗培养5 d后光照培养25 d，观察不定芽的生长情况并计算增殖系数。增殖系数=不定芽个数/接种的茎段或顶芽数。

表1 白果蒲桃不定芽诱导试验的因子水平表1)Table 1 Factor levels of adventitious buds during induction test

1.2.4 生根诱导培养基的筛选 将不定芽诱导培养获得的3～5 cm单芽切下，接种到生根诱导培养基中培养。共设计6组生根培养基：(1)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA；(2)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA；(3)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.4 mg·L-1IBA；(4)1/2MS+0.2 mg·L-1NAA+0.6 mg·L-1IBA ；(5)1/2MS+0.4 mg·L-1IBA；(6)1/2MS+0.4 mg·L-1NAA+0.4 mg·L-1IBA，以上培养基均添加0.2 g·L-1活性炭、15 g·L-1蔗糖、7.0 g·L-1卡拉胶。每个培养瓶接入10个不定芽，每个培养基接种10瓶，重复3次。培养30 d后，统计生根数并计算平均生根率。通过多重比较法，利用方差分析，筛选出最佳组合的生根诱导培养基。平均生根率/%=(生根苗数/接种的不定芽数)×100。

1.2.5 培养条件 培养室温度设置为22～25 ℃；光照强度为2 000～3 500 lx；光周期为10～12 h·d-1。

1.3 统计与分析

采用GPS数据分析软件和Excel 2015进行数据的统计与分析。

2 结果与分析

2.1 HgCl2消毒处理对白果蒲桃种子无菌体系建立的影响

由表2可知，不同处理间白果蒲桃种子污染率与存活率差异均达极显著水平。当消毒时间从20 min延长至30 min时，污染率从100%降低至7.5%，此时种子无死亡现象，且存活率最高，达92.5%；消毒时间为35 min时，种子出现死亡现象，且污染率有所升高，存活率为76.0%，这可能是由于消毒时间过长导致白果蒲桃种皮损伤严重，剥掉种皮时会残留一部分在种子上，导致污染率有所上升。综合来看，0.1% HgCl2的最佳消毒时间为30 min。

表2 HgCl2消毒时间对白果蒲桃种子无菌体系建立的影响1)Table 2 Effect of HgCl2 disinfection time on the establishment of aseptic system of S.album seeds

2.2 培养基对白果蒲桃种子萌发的影响

由表3可知，添加一定浓度的活性炭和蛋白胨有利于白果蒲桃种子的萌发。当培养基中未添加活性炭时，种子萌发的天数最长，达45.5 d，萌芽率最低，为78.3%；添加0.2 g·L-1活性炭可缩短种子萌发天数，提高萌发率，此时种苗叶片舒展，生长健壮，萌发天数和萌芽率与无添加时对比差异显著；当活性炭浓度为0.5 g·L-1时，苗茎细弱，可见活性炭的浓度不宜过高。添加一定浓度的蛋白胨有助于种子的萌发，当蛋白胨浓度达到0.4 g·L-1时，萌发天数最短，萌芽率最高。

表3 活性炭及蛋白胨浓度对白果蒲桃种子萌发的影响1)Table 3 Effects of contents of activated carbon and peptone on germination performance of S.album seed

综上所述，本试验选择的最佳种子萌发培养基为：MS+0.2 g·L-1活性炭+0.4 g·L-1蛋白胨+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1琼脂。该培养基下种子的萌发天数为32.4 d，萌发率达94.5%，种子苗生长健壮(图1)。

图1 白果蒲桃无菌实生苗Figure 1 S.album seedlings germinated in aseptic system

2.3 培养基对白果蒲桃不定芽增殖的影响

将白果蒲桃实生苗切成茎段及茎尖，接种到不定芽诱导增殖培养基上培养，20 d左右可观察到不定芽(图2)。白果蒲桃不定芽增殖培养正交试验结果见表4。各处理的不定芽增殖系数不同，其中处理2的平均增殖系数最高，为3.20。正交试验分析表明，白果蒲桃的最佳增殖培养基组合为A2B2C2，即1/2MS+0.8 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1琼脂。

由表4中R值分析表明，基础培养基、6-BA、NAA三因子对白果蒲桃增殖培养的影响力大小依次为：6-BA>基础培养基>NAA(B>A>C)。方差分析(表5)显示，3个因子对白果蒲桃增殖系数的影响均达极显著水平。

表4 白果蒲桃不定芽增殖培养正交试验结果1)Table 4 Orthogonal test on proliferation culture of S.album adventitious bud

表5 白果蒲桃不定芽增殖培养正交试验方差分析表1)Table 5 Analysis of variance on orthogonal test on proliferation culture of S.album adventitious bud

2.4 培养基对白果蒲桃不定芽生根的影响

选择高3～5 cm且带有4片以上叶子的白果蒲桃不定芽。切下不定芽并接种到生根诱导培养基中，培养20 d左右可观察到基部长出白色根原基(图3)。培养35 d后将生根苗移出培养室炼苗。由表6可知，IBA和NAA对白果蒲桃不定根的形成均有促进作用。当NAA浓度为0.2 mg·L-1时，随着IBA浓度增加，平均根数和生根率呈先提高后降低趋势；IBA浓度为0.4 mg·L-1时，平均根数最多，生根率最高，与其他3个浓度水平差异显著。因此，白果蒲桃不定芽最佳生根诱导培养基为：1/2MS+0.4 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1NAA+0.2 g·L-1活性炭+15 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶时，此时平均根数为3.5根，平均生根率达70.9%。

图3 白果蒲桃不定根的诱导培养Figure 3 Induction and culture of adventitious roots of S.album

表6 IBA和NAA浓度对白果蒲桃不定芽生根的影响1)Table 6 Effects of IBA and NAA on rooting of S.album adventitious buds

3 讨论与小结

通过林下落地种子自然播种或人工土播，白果蒲桃种子发芽率均极低[3,10]，吴地泉[3]开展了白果蒲桃幼苗移栽试验，发现其移栽成活率极低。而本研究采用无菌播种方式，种子萌发率达94.5%，萌发天数为32.4 d，克服了人工播种萌芽率极低的难题。白果蒲桃人工播种萌芽率低可能与其种子萌发时种皮脱落，胚乳易受外界细菌或真菌侵袭而导致败育有关，而通过组培播种可获得无菌种子，提高萌芽率。

本试验首次以白果蒲桃的种子作为外植体，开展白果蒲桃组织培养技术研究，发现其最佳增殖培养基为：1/2MS+0.8 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1琼脂；不定芽最佳生根诱导培养基为：1/2MS+0.4 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1NAA+0.2 g·L-1活性炭+15 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶，平均根数为3.5，平均生根率达70.9%。今后将对无性系进行移栽种植并筛选出优良无性系，为园林绿化提供优质白果蒲桃种苗。