香蕉CASP家族全基因组鉴定与分析

季宇航, 张春渝, 李 丹, 赖钟雄

(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

凯氏带(Casparian strip)是被子植物中位于内皮层细胞四周并呈带状环绕在内皮层径向壁和横向壁上的结构，控制皮层和维管柱之间的物质运输[1]。植物根系吸收的水分和矿质元素一般通过两种途径进入细胞：一种是通过细胞壁和细胞间隙的质外体途径；另一种是通过质膜和原生质的共质体途径。由于凯氏带的存在和内皮层细胞的物理结构，水和矿质元素不能从质外体进入细胞，所有的水分和无机盐只有经过内皮层的原生质体才能进入维管柱[2]。凯氏带蛋白(Casparian strip membrane domain proteins, CASP)是特异性出现在凯氏带形成区域的膜蛋白[3]，对凯氏带的形成起着至关重要的作用。目前，凯氏带基因在一些物种中已有研究。Roppolo et al[3]发现拟南芥的5个凯氏带蛋白存在功能冗余的现象，例如CASP1-1异常却不影响凯氏带的阻滞功能，推测凯氏带的形成是多基因形成的复合体共同作用完成的[4]。Wang et al[5]在水稻根内胚层细胞中发现，OsCASP1基因能在水稻根内与其同源基因发生互作合成复合物从而影响凯氏带的形成。OsCASP1～OsCASP5基因中仅有OsCASP1参与凯氏带的形成过程，对水稻根中矿质元素，尤其是钙和硅的吸收起作用[6]。除此之外，凯氏带蛋白还参与了植物耐寒、盐胁迫等生命过程[7-8]。丁长庆[9]研究表明，西瓜CICASPL及其同源基因AtCASPL4CI在低温胁迫下都能够被诱导表达，二者能够负调控植株的低温抗性。

香蕉(Musaspp.)是热带、亚热带广泛种植的水果，对温度的变化极其敏感，耐低温能力差。低温逆境对香蕉的产量与品质产生巨大的影响。目前，尚未见有关香蕉CASP基因的系统分析及其在低温下表达情况的报道。本研究以香蕉基因组数据库中A、B基因组的CASP家族基因数据为种子序列，通过生物信息学分析手段对香蕉全基因组CASP家族基因进行鉴定，并结合香蕉低温转录组数据对CASP在低温下的表达情况进行分析，旨在为香蕉CASP基因家族功能研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用的香蕉基因组序列来源于香蕉基因组数据库网站(http：//banana-genome-hub.southgreen.fr/)，所用拟南芥、水稻的参考序列分别从TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)和Phytozome(http：//www.phytozome.net/)网站下载。

1.2 香蕉CASP家族成员基本信息及理化性质的获得

基于香蕉基因组数据库下载了CASP家族基因CDS序列、氨基酸序列、基因结构注释信息文件以及全基因组序列，通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上的Blast软件(E=1e-5)在线筛选香蕉A、B基因组中的CASP基因家族成员。通过Pfam、CDD进行成员保守结构域的检测，将得到的结果在Tbtools软件[10]中进行可视化后进一步筛选。

将香蕉A、B基因组的CASP基因的氨基酸序列分别输入到Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)软件进行在线分析，从而得到该基因家族的理化性质预测结果。

1.3 香蕉CASP基因结构与蛋白质结构分析

将香蕉基因数据库上下载的氨基酸序列文件导入NCBI网站上进行CDD搜索，用Tbtools软件将得到的结果进行可视化。根据香蕉基因组数据库下载的基因注释文件，采用Tbtools软件分别对香蕉A、B基因组的CASP家族基因进行结构分析。

1.4 构建香蕉基因组CASP家族成员的系统进化树

用MEGA 7.0的Clustal W对香蕉A、B基因组的CASP基因进行多重序列比对，而后调整默认参数将自展法系数(bootstrap)调整为1 000，并采用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建拟南芥、水稻与香蕉A、B基因组CASP成员的系统进化树。

1.5 香蕉CASP家族的启动子顺式作用元件预测分析

将香蕉基因组数据库中的CASP家族基因序列导入Tbtools软件，提取各成员转录起始位点上游2 000 bp的序列作为启动子序列，采用Plantcare软件进行CASP家族成员的顺式作用元件预测分析。

2 结果与分析

2.1 香蕉CASP家族成员基本信息及理化性质分析

2.1.1 A基因组 香蕉CASP家族经Blast多重筛选后得到61个成员。其中，A基因组有44个，根据命名法编号为MaCASP01～MaCASP44。44位成员的CDS长度介于459～858 bp之间，相对分子质量介于38.9～72.6 kU之间，等电点介于5.05～5.22之间。

2.1.2 B基因组 香蕉B基因组中共有17个CASP成员，根据命名法编号为MbCASP01～MbCASP17。17个成员的CDS长度介于240～996 bp之间，相对分子质量介于19.8～266.6 kU之间，等电点位于5.04～5.34之间。

2.2 香蕉CASP家族基因结构与保守结构域分析

2.2.1 A基因组 香蕉CASP家族成员在基因结构上多表现为内含子和外显子的结构。其中，A基因组中CASP家族成员的基因大小在1～12 kb之间，内含子1～3个，外显子2～4个(图1A)。MaCASP06、MaCASP07、MaCASP08、MaCASP26和MaCASP41的内含子均为1个，MaCASP12、MaCASP18以及MaCASP22的内含子有3个，其余基因的内含子均为2个。除了MaCASP19，其余成员单个外显子在基因组上的跨度都较小。此外，MaCASP16不存在保守结构域，其余成员都至少存在1个保守结构域，主要为DUF588和MARVEL保守结构域(图1B)。

A.基因结构；B.保守结构域。图1 香蕉A基因组CASP家族成员的基因结构与保守结构域Figure 1 Gene structure and conserved domain of CASP family members in banana A genome

2.2.2 B基因组 由图2A可知，B基因组中CASP家族成员的基因大小在0.5～4.5 kb之间，内含子0～7个，外显子1～8个。MbCASP01、MbCASP02、MbCASP05、MbCASP09、MbCASP10、MbCASP11和MbCASP16的单个内含子长度较大，且MbCASP11的内含子数目最多。香蕉B基因组的CASP家族成员蛋白分布中除MbCASP03、MbCASP09以外，其余蛋白主要含有DUF588和MARVEL保守结构域(图2B)。此外，B基因组中MbCASP04、MbCASP05、MbCASP07与MbCASP17的保守结构域长度较短，可能由于蛋白的保守结构域有缺失。

A.基因结构；B.保守结构域。图2 香蕉B基因组CASP家族成员的基因结构与保守结构域Figure 2 Gene structure and conserved domain of CASP family members in banana B genome

2.3 构建香蕉CASP家族系统进化树

利用MEGA 7.0对香蕉A、B基因组以及水稻、拟南芥等3个物种共计113条CASP基因进行系统进化树的构建(图3)。参考拟南芥和水稻的聚类分析，根据基因的结构特征及同源性分析可将系统进化树中的香蕉A、B基因组的CASP家族成员大致分为5组。由图3可以看出，香蕉A、B基因组和水稻、拟南芥的CASP基因在各组中均有分布，分布在同一个组中的基因具有较近的亲缘性。

图3 香蕉A(Ma)、B(Mb)基因组以及水稻(Os)、拟南芥(At)CASP家族成员的系统进化树Figure 3 Phylogenetic trees of CASP genes in banana A genome (Ma), banana B (Mb) genome , rice (Os) and Arabidopsis (At)

2.4 香蕉CASP基因家族成员启动子顺式作用元件分析

2.4.1 A基因组 对启动子顺式作用元件进行分析是了解基因家族的重要方式[11]。本研究利用PlantCare在线软件预测香蕉CASP家族的启动子顺式作用元件。从图4可见，A基因组中CASP家族成员存在16种顺式作用元件，其中光响应元件最多。此外，还有众多功能各异的特异型元件，比如影响玉米醇溶蛋白代谢调节、种子特异性调节、水杨酸响应、低温响应、茉莉酸甲酯响应、参与昼夜节律控制、赤霉素响应、胚乳表达、干旱诱导性、细胞周期调控、生长素响应、缺氧特异性诱导、脱落酸响应以及MYB转录因子的结合位点等顺式作用元件。各成员包含的元件在种类和数目上不尽相同，这种差异意味着各成员参与信号通路的能力及生物学功能可能不同[12]。进一步分析发现，MaCASP01、MaCASP02、MaCASP08、MaCASP11、MaCASP18、MaCASP19、MaCASP22、MaCASP24、MaCASP25和MaCASP36等多个基因上含有影响低温调控的顺式作用元件，表明香蕉A基因中CASP家族成员可能参与抗寒的逆境机制调节过程。此外，约40%的基因中含有影响干旱调控的顺式作用元件，说明A基因组中CASP家族基因可能在抗旱逆境调节中起作用。

图4 香蕉A基因组CASP家族的顺式作用元件Figure 4 Cis-acting elements of CASP family in banana A genome

2.4.2 B基因组 经筛选，B基因组中CASP家族成员存在11个主要顺式作用元件(图5)。与A基因组不同的是，B基因组中存在影响类黄酮生物合成基因调控和分生组织表达的元件。MbCASP01中含有3个生长素反应元件，暗示着该基因可能在生长素反应中发挥作用。MbCASP12、MbCASP13、MbCASP14、MbCASP16和MbCASP17中只包含光响应元件，说明这5个基因可能主要参与光响应。MbCASP1、MbCASP3、MbCASP4、MbCASP6、MbCASP7、MbCASP9和MbCASP11都含有3种以上的顺式作用元件，表明这些基因可能在植物的生理调控上起重要的作用。MbCASP04和MbCASP15等基因含有低温响应元件，表明这些基因可能参与香蕉的低温逆境响应过程。约30%存在参与干旱调节的响应元件，暗示着这些基因可能与抗旱机制调节相关。

图5 香蕉B基因组CASP家族的顺式作用元件Figure 5 Cis-acting elements of CASP family in banana B genome

2.5 香蕉CASP家族在低温下的表达分析

通过转录组数据对香蕉CASP的低温表达情况分析表明，在13 ℃下，4个成员(MaCASP20、MaCASP26、MaCASP27、MaCASP44)的表达量较28 ℃显著升高；6个成员(MaCASP21、MaCASP19、MaCASP32、MaCASP43、MaCASP11、MaCASP16)在4 ℃时呈特异表达；MaCASP10在0 ℃时呈现特异表达(图6)。以上表明，这些成员在低温下可能发挥作用。

图6 香蕉CASP家族成员在不同低温处理下的表达分析Figure 6 Expression analysis of CASP gene family members under different low temperature treatments in banana

3 讨论

3.1 香蕉CASP家族可能具有功能多样性

MYB转录因子通过调控木质部的形成影响凯氏带的结构从而在植物的形态建成、生长发育中起着重要的调控作用[13]。凯氏带能够阻断植物中物质的被动运输[14]，其功能与结构息息相关。香蕉A、B基因组的CASP家族基因都含有大量的MYB结合位点，猜测其可能间接影响凯氏带的结构。根据前人研究，CASP家族作为广泛存在于被子植物物质运输途径的家族，对凯氏带的形成发挥了重要作用[4-7]。此外，香蕉CASP基因家族中还含有其他众多类型的顺式作用元件，其中光响应元件数量最多，可以判断CASP家族基因对昼夜节律调控有较大的影响。基因中还包括许多激素、生长素反应的元件，说明香蕉CASP基因家族可能参与了植物的多项生命过程。

3.2 CASP家族在香蕉A、B基因组及不同物种中具有序列差异性

从基础理化性质来看，相较于A基因组，B基因组中的CASP家族编码氨基酸的数目跨度更大，相对分子质量差异也比较显著。此外，MaCASPs的结构完整，内含子、外显子跨度小且具有较强的连续性。MbCASPs则在结构上有所缺失，不同基因的内含子与外显子数目差异较大。从顺式作用元件分析可以看出，两者都具有较多类型的响应元件，但不同于A基因组的是，B基因组中CASP基因可能与类黄酮等生物合成有关。

CASP家族在不同的物种中也存在差异。相较于水稻、拟南芥的CASP家族成员数量，香蕉CASP成员数量较多，A基因组有44个、B基因组有17个。猜测香蕉CASP家族基因的成员数比其他植物多的原因可能与其经历了3次全基因组复制有关[15]。CASP蛋白在不同的物种中也存在保守结构域上的差异。在拟南芥、香蕉中存在CASPL(MARVEL)结构域，而目前在水稻中并未发现相似的保守结构域。说明CASP基因家族成员在不同物种中存在一定的差异。

3.3 香蕉CASP家族可能参与逆境胁迫过程

从A、B基因组的元件类型可以看出，CASP家族基因对逆境调控元件有较强烈的应答，推测可能参与多种抗逆境反应。Yang et al[7]研究发现，西瓜中存在编码冷诱导膜蛋白的ClCASPL基因，该基因与拟南芥的类CASP基因(AtCASPL4C1)存在较高的同源性，且都对植物的耐寒性起到一定的作用。刘炜婳[16]研究表明，香蕉中存在4种抗寒重叠基因，对抗逆境胁迫产生显著影响。香蕉A、B基因组的CASP家族中同样存在低温响应顺式作用元件，说明可能参与了低温胁迫的响应。分析低温转录组数据表明，MaCASP的一些成员可能在低温诱导下特异表达。说明它们可能在香蕉的低温响应中起作用，具体功能还需进一步验证。