不同方法检测食源性致病菌的对比研究

苏 敏

（太原市市场监管综合行政执法队，山西太原 030031）

随着人们生活水平的不断提升，人们对食品安全问题的关注度也越来越高，食品安全问题也是全球共同关注的公共卫生问题，其中食源性致病菌是最大的威胁，为此要采用高效的检测手段来检测食源性致病菌，才能保障食品安全。在食品安全事件当中，最为常见的食源性致病菌有副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等，当前我国将细菌培养法运用至食物病原菌的检测当中，但是由于操作步骤烦琐、用时长等，很难满足当前公共卫生事件快速反应的需求[1]，为此，检测方法必须符合特异性高、灵敏度高、快速等要求，而荧光PCR 法作为食源性致病菌的检测方式，得到了广泛的运用。基于此，为了选择更加有效的食源性致病菌检测方法，本文分别比较了细菌培养法以及荧光定量RCR 法的检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料

荧光定量PCR 仪（型号：ABI7500），美国ABI 公司；检测用试剂，均由青岛海默技术有限公司提供；API 鉴定生化试条，法国梅里埃公司；荧光PCR 检测试剂、样本处理DNA 提取液，均由上海之江生物科技有限公司提供。

1.2 样本来源

选取时间为2020 年6—12 月，选取250 份样本，包括即食非发酵豆制品（50 份）、速冻熟制米面制品（50 份）、熟肉制品（50 份）、生禽肉（50 份）和生畜肉（50 份）。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养

对食品样本中的副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌严格按照《全国临床检验操作规范（第3 版）》[2]中的操作流程，对细菌进行分离操作、培养以及鉴定。

1.3.2 荧光PCR 检测

（1）制备菌株基因组DNA。选择每个标准的单个菌落，采用细菌基因组DNA 试剂盒，严格按照其说明书的内容提取每个菌种的基因组DNA 并保存（-20 ℃），将其作为阳性对照。

（2）样本处理和DNA 提取。在无菌的环境下，选取食品样本25.0 g，将其放入无菌培养基（225 mL）中，增菌24 h（37 ℃），提取增菌液的（50 mL）DNA，采用相应的试剂盒进行检测。

（3）PCR 扩增。选择食品样本中的DNA 以及标准菌株的DNA 为模板，应用特异性引物、探针实施PCR 扩增。体系（25 µL）包括标本DNA 提取物5 µL+混合酶0.5 µL（UNG酶+Taq 酶）+PCR 反应液19.5 µL。UNG 处理时间为2 min（50 ℃反应条件下）；预变性95 ℃，时间为3 min；95 ℃，时间为5 s；55 ℃时间为60 s，共计40 个循环。

1.4 阳性判定结果

实验有效，Ct ≤30，且存在明显指数增长期判定为阳性；Ct 值＞35 或者无Ct 值，则为阴性。当Ct 值在30～35，应即刻重复检验。当Ct 值在30～35，且存在较为明显的指数长期增长，判定为阳性[3]，反之为阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS22.0 展开详细分析，数量数据采用（%）体现，χ2互比检验，如P值＜0.05，则表示为具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 检测结果

本次选取的实验室细菌培养物灵敏度是4.9×102CFU/mL，而选用的DNA 检测灵敏度为0.1 pg，从样本中采用细菌培养共检出副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌等常见致病菌，分别为9 株、13 株、10 株、15 株，共计47 株，细菌培养总检出率为18.80%。

2.2 荧光定量PCR 检测和细菌培养阳性检出率比较

细菌培养法阳性率（18.80%）与荧光定量阳性率（20.0%）互比差异微小χ2=0.890，无统计学意义（P＞0.05），详细数据见表1。

表1 荧光定量PCR 检测和细菌培养法阳性检出率表

2.3 讨论

食品安全已然是全世界的公共卫生问题，而因为食品安全问题导致的食源性疾病已得到全社会的关注，据相关数据统计[4]，每年因微生物所引发的食源性疾病占所有疾病的80%，在此严峻的背景之下，我国卫生部早在2 000 年已经建立了食源性疾病、污染物监测网，然而对食品样品的食源性致病菌检测主要还是沿用血清学、生化学、细菌培养等，检测的周期较长，且具有较低的灵敏度，为此已然不适应当前突发事件的食品安全保障工作。伴随着分子生物学检测技术水平的不断提升，PCR 得到了众多研究者的认可，其中荧光PCR 检测所具有的特异性强、灵敏度高、快速有效的优势已经被广泛的应用于各种病毒、致病菌的检测当中，为此荧光定量PCR 检测已经成为当下微生物学检测最有利的工具。

细菌培养技术作为传统检验食源性致病菌的技术，其检测原理是通过对食品样本内的微生物进行培养，再划线分离，实施选择性培养，观察菌落的特征，最后鉴别致病菌的种类[5]。由于生物技术的不断发展，显色培养基因其具有较强的特异性、极高的灵敏度，已经被应用于食源性致病菌的检测当中，有效地提升了检测效率。借助微生物鉴定系统能够有效减少检测步骤、缩短检测时间，也能保障检测结果的准确性，而传统细菌培养技术在实际应用中操作流程烦琐，检测用时长，不能满足当前的检测需求。

PCR 检测技术充分运用了每类生物所具有的核酸片段特异性，通过含有放射性同位素探针的补体核酸片段进行检测。PCR 检测技术在检测沙门氏菌中效果突出，检测中操作步骤简单易行、检测时间短，其结果准确性高，不仅广泛地应用于食源性致病菌的检测当中，也被其他领域所运用，为此逐渐延伸出电化学发光PCR 检测技术、逆转录PCR 检测技术、荧光定量PCR 检测技术等，并且已经成为了检测食源性致病菌的标准。其中荧光定量PCR 检测技术就是本次研究的方法之一。

本次的研究发现：①食源性致病菌的检测是控制和预防食源性疾病最重要的一环，虽然我国已经制定了食物中毒病原检测方法——细菌培养，但是众多缺点很难满足公共卫生事件快速反应需求；②本次食源性致病菌样本较多，为此细菌培养检测从检验、培养基制备、样品增菌前处理、分离培养、生化试验到鉴定整个过程需要5～6 d 的时间，且检测的结果非常容易受到多种因素的影响，例如检验技术、生化鉴定技术、培养基质量等，且手工分离培养鉴定过程中，检出率在一定程度上存在误差，因此细菌培养在食源性致病菌检测当中具有一定的局限性[6]；③经过众多研究者的证明，实时荧光定量PCR 技术的重现性佳、准确性高，已经被广泛地应用至病原体、基因表达各个领域，其操作简单、快速、特异性、灵敏度的优势有效地提升了检测工作效率，能够实现和满足病原微生物快速高通量的检测需求，但实际应用中依然存在弊端。由于PCR 检测为核酸，样品中的细胞无论是死亡亦是存活，都能够扩增出核酸片段，为此可能会出现假阳性的结果。由于整个检验仅需9 h 左右，有效地提升了检测效率，更为细菌分离培养提供了初步信息，同时提供了实验室在分离培养操作中的考虑方向，并缩短了分离培养烦琐的过程。更为重要的是由于致病菌核酸试剂盒的条件一致，亦能将同一份样本在同一台仪器上进行多种检测，故优势更为突出。

总之，在检测食源性致病菌当中的技术众多，每种技术均具有优点和缺点，在实际应用中应充分发挥其优势，必要时联合多种检测手段，以此来提升食源性致病菌检测结果的准确性，进而保障食品安全[7]。

3 结论

通过本次研究结果显示来看，细菌培养法阳性率（18.80%）与荧光定量阳性率（20.0%）互比差异微小χ2=0.890，无统计学意义P＞0.05，充分证明两种检测方法在食源性致病菌检测当中均具有一定应用价值，但是荧光PCR 的优势时限、结果、效率远远高于细菌培养，更加适合应用与食源性致病菌的检测当中。综上所述，荧光PCR法应用在食源性致病菌检测当中，可提升检出率、缩短检测用时、提高检测效率，故值得借鉴和推广。