生姜蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达

卢 瑛

（莱芜职业技术学院，山东莱芜 271100）

生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain,EC 3.4.22.67）是存在于生姜块状根茎中的一种巯基蛋白酶，有两种GP-I 和GP-II（GPI 和GPII 分别与GenBank 中GP3 和GP2 同源性较高），均含有221 个氨基酸，含有6 个Cys 形成3 个二硫键为糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能够水解胶原蛋白，可用于肉类嫩化、酒类澄清，乳制品凝固等［1］，以姜汁为添加剂开发的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在广东地区颇受欢迎，因此该酶具有良好的工业化应用前景［2］。

生姜蛋白酶的分离纯化工艺操作复杂，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品种、不同栽培地区及不同气候条件下差异非常大，甚至同一品种的干姜与生姜之间的含量也不相同，导致生姜蛋白酶的提取率不稳定［3］。尤其生姜常年连作导致茎腐病、斑点病和姜瘟病高发，推升了市场上生姜的价格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，进一步限制了生姜蛋白酶的开发利用。

本实验从莱芜生姜中提取总RNA，通过RT-PCR 技术扩增生姜蛋白酶基因，并构建了pET-GPII 原核表达载体，重组质粒在大肠杆菌BL21 中实现了原核表达，为生姜蛋白酶工程化生产进行了探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种、质粒和植物材料

大肠杆菌DHB4 和宿主菌BL21 以及质粒pET30a（+）为本实验室保存，莱芜生姜购于莱芜大润发超市。

1.1.2 酶、试剂盒和生化试剂

dNTP、DL2000、EasyTaq DNA 聚合酶、TransStart FastPfu DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；植物总RNA 提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；T4 DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；限制性内切酶KpnI、XbaI、EcoRI 和反转录试剂盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit 购自ThermoFisher 公司；DNA 凝胶回收试剂盒和DNA 质粒提取试剂盒购自OMGEA 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生姜蛋白酶cDNA 的合成

根据植物总RNA 提取试剂盒操作说明分离提取生姜总RNA，将RNA 利用反转录试剂盒合成cDNA 并稀释至50 ng/µL。

1.2.2 引物的设计与合成

根据Gen Bank（NCBI）数据库中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI:57118005）和GP3a（GI:57118009）的上下游序列设计特异性引物，以生姜mRNA 反转录产物（cDNA）为模板，PCR 克隆生姜蛋白酶基因。两对特异性引物，分别为GP2a 上游引物：5’-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTA GACAAT-3’，下游引物：5’-ATTAAAGCTTTGCACTGC TCTTGAGACCTCC-3’；GP3a 上游引物：5’-ATTTGGAT CCATGGCTTCCTTCGTCGC-3’，下游引物：5’-ATTAG TCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3’；GPII 上游引物：5’-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3’，下游引物：5’-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCT CC-3’。

1.2.3 生姜蛋白酶原核表达载体的构建

以稀释后的cDNA 为模板，PCR 扩增生姜蛋白酶基因。PCR 反应程序按照TransStart FastPfu DNA 聚合酶说明书执行。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。将回收的PCR 产物交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序，并与Gene Bank 上已发布的序列进行比对。以GP2 序列为模板克隆GPII 片段，并连接到表达载体pET30a（+）载体上转化感受态DHB4，经Kan+抗性的LB 固体培养基筛选。挑取抗性重组子测序，将序列正确的克隆命名为pETGPII。提取重组质粒转化BL21 感受态细胞。

1.2.4 生姜蛋白酶表达条件优化

将携带重组表达载体pET-GPII 的工程菌BL21 在LB 培养基上培养至OD600为0.4 时，分别加入0～0.5 mmol/L 不同浓度的IPTG，37 ℃诱导4 h，并通过SDS 电泳分析IPTG浓度对诱导结果的差异。进一步在加入0.1 mmol/L 的IPTG条件下诱导0～10 h 不等的时间，分析不同诱导时间对诱导结果的差异。

2 结果与分析

2.1 生姜蛋白酶基因的克隆与原核表达载体构建

通过RT-PCR 成功获得与目的基因大小相符的DNA 片段。将该片段连接到原核表达载体pET-30a（+）并进行测序，GP2 序列全长为1 146 bp，GP3 为1 401 bp。序列比对发现与GP2 与GP2b（GI:57118006）同源性为99.91%，仅在945 位碱基发生改变，与GP2a（GI:57118005）相同位置的碱基一致。GP3 与GP3b（GI:57118011）同源性为94.77%，有451、700 和804 这3 个位置的碱基发生改变，与GP3a（GI:57118009）相同位置上的碱基一样（如图1 所示），说明了不同品种生姜蛋白酶基因的多样性。进一步以GP2 为模板，克隆出了726 bp 的GPII 片段［4］，并将其连接到原核表达载体pET-30a（+）构建重组表达载体pET-GPII。

图1 生姜蛋白酶基因序列

2.2 生姜蛋白酶的诱导表达及诱导条件优化

将重组表达载体pET-GPII 转化宿主菌BL21，培养单克隆菌落至OD600=0.4，然后添加IPTG，浓度为0.05 mmol/L，发酵1 h，4 h，6 h 和10 h，以未添加IPTG 的pET-GPII 的菌和转化空载体的菌为对照组，结果发现当诱导时间达到6 h 以后，目的基因的蛋白表达量没有显著变化（图2A）。当加入不同浓度的IPTG 时，发现0.1 mmol/L 的IPTG 诱导表达的蛋白量最多（图2B）；因此推断最佳诱导条件为37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG 诱导6 h。

图2 SDS-PAGE 检测生姜蛋白酶的表达

3 结论与讨论

近年来随着对生姜蛋白酶的深入研究，发现生姜蛋白酶对肉类具有良好的嫩化作用，对于酒类的澄清效率远高于木瓜蛋白酶，还可作为凝乳剂来制作风味乳品。用生姜蛋白酶制备的奶酪，口感好，无苦涩感［5-6］，说明生姜蛋白酶具有潜在的商业应用价值。

原核表达系统具有遗传背景清晰，细胞生长周期短，增殖速度快，发酵产量高，易于工程化等优点而受到欢迎，而且优化发酵条件可以使目的蛋白以可溶的形式生产。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因，并在原核表达系统中成功诱导表达，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG 诱导条件下表达6 h 产量最高。这为生姜蛋白酶工程化生产提供了理论基础。