Toll样受体4与阴道微生态的相关性研究进展

宋悦筱 刘 楼 许涵洁 陈佳乐 陈 钰 陆牡丹 陈道桢

Toll样受体(Toll Like Receptor,TLR)是一种模式识别受体(pattern recognition receptor , PRR)，微生物及其代谢产物入侵人体是通过识别PRR，激活固有免疫从而激活抗原特异性获得性免疫系统。TLRs是一个膜受体家族，在感知包括细菌、真菌和病毒在内的多种入侵病原体方面发挥着关键作用。TLR4是人类发现的第一个TLR，是介导信号转导的重要PRR，而且是唯一可以经髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88 , MyD88)依赖型和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)依赖型两条信号通路的TLR家族成员。TLR4具有多种不同结构的配体，如植物二萜紫杉醇、呼吸道合胞病毒的融合蛋白、纤连蛋白和热休克蛋白，其中最重要的配体是脂多糖。脂多糖是革兰阴性菌外膜的重要成分，有强大的免疫刺激活性，TLR4通过识别脂多糖激活下游信号通路，在机体的细菌感染和免疫反应中起着重要作用。

TLR4介导的炎症与免疫反应在女性生殖系统相关疾病中起着重要作用，而阴道微生态全程参与了女性生殖系统相关疾病的发生、发展。女性阴道微生态群落可以分为5组，其中4组以乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌为主，而第5组的乳杆菌比例较低，严格厌氧菌比例较高。阴道微生态中最常见的菌群是乳杆菌。乳杆菌主要是通过产生乳酸来维持阴道的微生态平衡，从而发挥抑制炎症的作用，除了乳杆菌外，阴道中的其他菌群也可能引起免疫反应，甚至会降解宿主粘膜，导致宿主更易感染。本文从TLR4的结构与功能、TLR4介导的信号通路及TLR4与阴道微生态的关系3个方面对TLR4做一综述。

1 TLR4的结构与功能

1.1 TLR4的结构 TLR4是跨膜蛋白，其结构分为3部分，分别是含大量亮氨酸重复序列的胞外区、跨膜区，以及与衔接蛋白相互作用的胞质区。这个与衔接蛋白相互作用的胞质区即为TIR(Toll/interleukin-1 receptor domain , TIR)结构域，激活后TIR作为一个支架来募集衔接蛋白。衔接蛋白MyD88、MyD88连接蛋白(MyD88-adaptor like, Mal)、TRIF、TRIF相关的接头分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)和SARM蛋白同样有TIR结构域，通过同源性TIR结构域，衔接蛋白可以与TLR相互作用，激活其下游一系列信号通路。

1.2 TLR4的功能 TLR4最重要的功能之一是其可以识别革兰阴性菌脂多糖，激活免疫反应，在炎症反应和肿瘤微环境中起着重要作用。研究发现，虽然不同TLR的连接靶点不同，但不同TLR可以共享信号通路，诱导固有免疫反应。TLR识别配体和信号转导依赖于从胞膜、胞质到胞核的许多分子，这些分子可以通过交叉调节、蛋白质修饰、辅助辅因子等调节TLR的反应。TLR4是第一个被发现的TLR家族成员，早在1998年Beutler等发现哺乳动物TLR4蛋白可识别脂多糖，并可能通过质膜传递脂多糖信号，同时也发现TLR4基因突变可导致革兰阴性菌脓毒症，破坏免疫功能。一项在鸡的阴道细胞中的研究发现，TLR4还可以识别阴道细胞表达的促炎细胞因子和趋化因子。

2 TLR4介导的信号通路

TLR的信号通路涉及5种衔接蛋白，即MyD88、MAL、TRIF、TRAM和SARM，介导一系列的信号传导。TLR4信号通路在整个TLR介导的信号通路中占有重要地位。TLR4是介导信号转导的重要PRR，而且是唯一可以经MyD88依赖型和TRIF依赖型两条信号通路的TLR家族成员。

TLR4的MyD88依赖的信号通路是TLR4经典的信号通路，在识别细菌脂多糖方面非常重要。TLR4除了MyD88依赖的经典信号通路之外，还有涉及衔接子如MAL、TRIF、TRAM和SARM的非MyD88依赖的信号通路。TLR4介导的信号通路错综复杂，多条通路级联交叉，最终导致炎症及其他反应。了解TLR4介导的信号通路机制对于开发靶向药物，治疗炎性疾病以及改善肿瘤的炎性微环境有很重要的意义。

3 TLR4与阴道微生态的关系

3.1 阴道微生态的概念及其临床意义 女性的阴道微生态不仅仅指阴道菌群，而是一个整体的概念。在通常状态下，阴道微生态由4个成分组成，分别是正常的阴道解剖结构、周期性的内分泌变化、阴道局部免疫系统以及阴道各种菌群。正常和异常阴道微生物群是由200多种细菌组成的复杂生态系统，受基因、种族背景、环境和行为、雌激素、抗生素、避孕药等影响，阴道微生物群是动态变化的。

阴道微生态与女性常见的生殖道感染如细菌性阴道病、阴道念珠菌病、淋病、尿路感染，甚至妇科肿瘤都有着密切的联系，是阴道微生态的失衡导致疾病的发生，还是疾病引起阴道微生态的改变的因果关系尚未清楚，但公认的一点是阴道微生态对女性泌尿、生殖系统健康十分重要。在治疗方面，对于常见的女性生殖道感染通常的治疗手段为抗菌药物、激素、益生菌，通常使用抗菌药物是为了消除致病菌，恢复正常的阴道菌群平衡，益生菌也有助于女性恢复健康的阴道微生态，阴道微生态在女性生殖道疾病中无论是病因方面还是治疗方面都起着十分重要的作用。阴道微生态是在动态变化的，其中阴道菌群是阴道微生态的重要组成部分，在阴道微生态中各种菌群失衡必然会引起阴道微生态的失衡，进而导致多种妇科疾病的发生。

3.2 TLR4与阴道微生态平衡

3.2.1 TLR4与阴道优势菌群 乳杆菌是女性阴道微生态中的优势菌群。Mendling等研究发现个体的阴道健康主要是由几种乳杆菌支配的。这些乳杆菌与抗菌物质、细胞因子、防御素和其他抵抗菌群失调、感染的物质以及对非早产的正常妊娠的护理一起支持防御系统，并且在菌群失调的情况下，乳杆菌的数量会增加。乳杆菌也是常见的益生菌，可以激活巨噬细胞和树突状细胞分泌细胞因子，从而调节宿主的免疫反应。乳杆菌产生的高浓度乳酸是决定阴道微生态的健康和失调的最重要因素，乳酸可以使阴道酸化，但在阴道微生态失调状态下乳酸急剧下降，阴道pH值增大，并且乳酸在抗菌、抗病毒和免疫调节中也起着十分重要的作用。

乳杆菌在调节肠道中的炎症时也起到关键作用。Compare等用炎症后肠易激综合征离体器官培养模型研究乳杆菌对粘膜炎症的影响，发现干酪乳杆菌-DG能显著降低脂多糖刺激后促炎细胞因子和TLR4的mRNA表达。乳杆菌在肠道中可以下调TLR4的mRNA水平，从而减少炎症反应，乳杆菌在肠道对TLR4的影响已经有较多的研究，但乳杆菌在阴道对TLR4的影响的研究还不够充分。

Rahbar等研究了阴道分离的乳杆菌对TLR4信号转导的调节作用，发现在条件培养基(加入乳杆菌的胚胎牛血清的RPMI培养基)处理的CAOV-4细胞中，TLR4的mRNA和蛋白水平降低，但大肠杆菌(作为病原体阳性对照)处理的CAOV-4细胞中TLR4的mRNA和蛋白水平显著升高。乳杆菌在阴道和肠道中一样可以使TLR4的mRNA 和蛋白水平降低，从而减少炎症反应。然而，Oerlemans等的一项关于需氧菌性阴道炎(aerobic vaginitis, AV)的研究发现，在大部分的AV患者中乳杆菌的丰富度降低，一些潜在的病原体或致病菌较正常阴道微环境增加了，但仅轻微刺激了TLR4，并且减少了TLR2/6的激活，研究人员推测可能是AV导致了阴道微生态的改变，而不是阴道微生态的改变导致了AV，因此恢复女性阴道微生态和乳杆菌平衡的益生菌在治疗AV中具有重要意义。

TLR4介导的信号通路在炎症反应中意义重大。在过去对于人体微生态的研究中，肠道菌群是一个研究热点，乳杆菌在肠道中可以降低TLR4的mRNA水平从而减少炎症反应。从研究肠道中的乳杆菌转到阴道中的乳杆菌，研究人员发现阴道中的乳杆菌同样可以降低TLR4的mRNA水平,从而减少炎症反应。乳杆菌在女性阴道微生态和女性生殖道健康中的作用是十分重要的，其原因之一就是上文所述的乳杆菌可以调节TLR4介导的信号通路，而TLR4信号通路十分复杂，不止于上文涉及的TLR4/NF-κB信号通路，研究乳杆菌对TLR4信号通路上其他调控原件的影响，探索乳杆菌调控TLR4信号通路上更加完整的机制，将有助于更有效的抗炎药物甚至抗癌药物的研发。对于阴道微生态失衡与女性生殖道炎性疾病甚至癌症的因果关系至今尚未明确，但无论因果，恢复女性阴道微生态平衡的益生菌对于女性生殖道健康都是有益的。

3.2.2 TLR4与阴道非优势菌群

3.2.2.1 TLR4与淋病奈瑟菌 淋病奈瑟菌可以导致淋病，育龄女性感染严重淋病后会增加盆腔炎、异位妊娠和不孕等发生风险。淋病奈瑟菌严重危害女性健康,其是一种常见革兰阴性菌，外膜有丰富的脂多糖。为了研究脂多糖及其同源受体TLR4在女性生殖道急性淋病奈瑟菌感染黏膜反应中的作用，Andrade等研究发现，淋病奈瑟菌感染诱导的 I 型干扰素依赖于cGAS/STING和TLR4信号通路。Packiam等用经阴道接种淋病奈瑟菌的小鼠进行实验，发现TLR4信号通路可以调控女性生殖道淋病奈瑟菌感染早期的炎症反应和控制细菌的复制。Yang等研究了TLR2和TLR4在子宫内膜上皮细胞感染淋病奈瑟菌后引起的损伤中的作用，发现淋病奈瑟菌可以抑制细胞活力，诱导细胞凋亡和炎症反应，若TLR2/TLR4减少，可延缓由感染引起的细胞凋亡和炎症，抑制感染引起的损伤。

淋病奈瑟菌感染引起的炎症反应受到TLR4介导的信号通路的调控，当TLR4减少时，淋病奈瑟菌感染引起的炎症反应也减少了。目前常用的治疗淋病的方法是使用抗生素，抗生素的耐药性问题在我国十分严峻，针对TLR4信号通路上的多个靶点，研发可以减少TLR4或其下游信号通路的制剂可以帮助临床治疗淋病甚至更多的感染和非感染性疾病。

3.2.2.2 TLR4与白假丝酵母菌 有研究表明，白假丝酵母菌可由共生模式转变为致病模式，引起念珠菌病。Wang等研究发现，白假丝酵母菌在遇到少量的氮气和丰富的血清时，会上调一个小的分泌型富含半胱氨酸蛋白Sell(一种富含半胱氨酸的小蛋白)的表达。这种Sell激活NF-κB和MAPK信号通路，导致促炎细胞因子和趋化因子的表达。研究人员综合遗传和生化分析发现，TLR2和TLR4都是识别Sell所必需的。该研究还证明了Sell能够在巨噬细胞和树突状细胞中同时参与TLR2和TLR4的促进炎症反应。

Roselletti等以健康女性、无症状白假丝酵母菌携带者和有症状的阴道念珠菌病患者为研究对象，发现无症状和有症状的受试者的内皮细胞中TLR2、TLR4和促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptorA2,EphA2)的表达水平显著高于健康受试者，转录因子、NF-κB和c-Fosp38基因(原癌基因)在有症状和无症状的假菌丝/菌丝携带菌者的内皮细胞中被激活，而在无症状的酵母菌携带者的内皮细胞中未被激活，且研究人员发现仅在有症状的患者中观察到内皮细胞的损害。

白假丝酵母菌可以引起念珠菌病，可累及患者的皮肤、黏膜甚至内脏。机体感染白假丝酵母菌后通过TLR2和/或TLR4进行识别，然后激活下游信号通路，最终激活NF-κB和MAPK信号通路，引起炎症反应。临床上通常用抗真菌药物来治疗白假丝酵母菌病，长期口服抗真菌药易导致肝、肾损伤，研发针对TLR4信号通路抑制白假丝酵母菌的药物将会有助于临床治疗。

3.3 益生菌在TLR4相关的阴道微生态中的应用 益生菌最初常用于改善肠道微生态。Yao等在研究益生菌对患有溃疡性结肠炎大鼠TLRs表达的调节作用时发现，接受双歧杆菌乳杆菌三联活菌片治疗的大鼠TLR4和TLR2的mRNA表达水平显著降低。TLR4介导的信号通路可以引起炎症反应，在肠道中某些益生菌可以减少TLR4的mRNA表达，从而减少炎症反应，达到对某些肠道疾病治疗的作用。

关于益生菌对TLR4介导的信号通路在阴道微生态中机制的研究还较少，但益生菌可以调节阴道微生态。乳杆菌是常见的益生菌，阴道中的乳杆菌可以降低TLR4的mRNA 水平从而减少炎症反应。所以可以大胆地推测益生菌可通过降低TLR4的mRNA 水平，来治疗某些疾病并调节阴道菌群。

益生菌在临床上可用于治疗妇科炎性疾病。Hanson等认为使用益生菌作为替代疗法或共同疗法可有效治疗和预防泌尿生殖器感染。Russo等研究发现益生菌混合物、乳铁蛋白与甲硝唑联合使用可显著改善细菌性阴道炎的症状，还可以改善Nugent评分和细菌性阴道炎的复发率。还有研究表明益生菌作为细菌性阴道炎常规治疗(硝基咪唑、克菌定)的补充使用，有助于预防复发；但Xie等研究发现，与常规治疗相比，使用益生菌作为辅助疗法可以提高外阴阴道假丝酵母菌病的短期治愈率和真菌治愈率，并降低在一个月内的复发率，但对长期的治疗效果似乎无影响。

在妇科炎性疾病的治疗中，我国常用的益生菌制剂是定君生，其是一种阴道用乳杆菌活菌胶囊。多项研究发现，复方甲硝唑栓联合定君生治疗细菌性阴道病效果显著,并且可以降低复发率。靳寿华以120例念珠性阴道炎患者作为研究对象，发现定君生联合硝呋太尔制霉素治疗念珠菌阴道炎，既可以清除念珠菌又可以改善阴道菌群及阴道的微环境。邹端等研究发现，定君生联合氟康唑可以有效治疗重度外阴阴道假丝酵母菌病，既能抑制致病菌的生长，又能改善阴道微环境。还有研究发现乳酸与氟康唑联合治疗外阴阴道假丝酵母菌病，可明显提高氟康唑的抗炎作用并且有效调节患者的阴道微生态。

TLR4作为识别革兰氏阴性菌，激活NF-κB信号通路的重要受体，是引起局部或机体免疫和炎性微环境改变的重要环节，一直以来广受研究人员的关注。阴道中的不同菌群只是阴道微生态的组成成分之一，只研究TLR4调控的阴道菌群是不够的，还应该对TLR4与阴道的结构、女性内分泌变化、阴道局部的免疫系统进行研究。阴道菌群中的一些致病菌如淋病奈瑟菌、白假丝酵母菌都可以通过TLR4/NF-κB信号通路引起妇科炎性疾病。未来的研究可以针对该信号通路上的靶点设计研发新的药物治疗妇科炎性疾病。由于TLR4介导的信号通路是复杂的，未来的研究还可以探讨TLR4介导的其他信号通路在调控阴道微生态上的机制，从而更全面的认识妇科炎性疾病甚至妇科肿瘤。