p21活化激酶4在恶性肿瘤进展中的生物学作用及其研究进展△

张哲铭，夏一涵，李耀宁，李晓东

中国医科大学1临床三系，2生命科学学院分子细胞生物学教研室，国家卫生健康委员会细胞生物学重点实验室暨教育部细胞生物学重点实验室，沈阳 110122

p21 活化激酶 4（p21-activated kinase 4，PAK4）是PAK家族的Ⅱ类代表性成员，其在多种肿瘤中存在基因扩增、基因突变以及蛋白过表达等现象，是肿瘤细胞信号的关键因子之一。PAK4活化后通过下游靶蛋白参与细胞骨架重组、伪足形成、基因转录、细胞周期等生物学行为，其异常高表达或过度活化后通过多种不同机制，促进肿瘤细胞的恶性转化和侵袭性转移。目前，恶性肿瘤病死率较高，严重威胁着人类的生命健康。因此，研究PAK4在不同肿瘤中的作用机制，通过抑制PAK4活性来抑制其参与的肿瘤生物学行为具有重大的临床意义。本文旨在从PKA4基本概况、研究进展、在相关肿瘤中承担的生物学作用以及针对该激酶抗肿瘤的最新研究进行综述。

1 蛋白激酶PAK4

蛋白激酶PAK4属于丝氨酸/苏氨酸蛋白家族的一员，在进化上高度保守，在细胞内承担着重要的生物学角色。PAK4属于PAK家族中Ⅱ类的代表成员，它通过结合或磷酸化下游靶蛋白发挥作用，在细胞周期的调控、细胞增殖、细胞运动等多方面都发挥作用，特别是在肿瘤的迁移与侵袭中作用明显。

1.1 蛋白激酶PAK4的结构特点

据相关报道，PAK激酶根据结构功能共分为两类，分别是位于-NH端的调控区域和高度保守的-COOH端的激酶活性域，这两类激酶都具有相同的可行使特征性功能的结构域。PAK家族的-NH端都有富含脯氨酸的部位，是PAK家族和相关蛋白SH结构域的结合位点，同时该部位还存在p21结合域（p21 binding domain，PBD），其为重要的功能调节域。然而，Ⅰ类PAK与Ⅱ类PAK的调控结构域在结构上不同，相较于Ⅱ类PAK，Ⅰ类的PAK激酶在结构上还发现一个自我抑制区域（auto inhibitory domain，AID），AID与PBD相互重叠以控制其活性。研究发现，Ⅱ类PAK激酶没有AID，但后来的研究发现在PAK4等Ⅱ类PAK激酶中有类AID结构域，此外，Ⅱ类PAK激酶激活机制也完全不同于Ⅰ类PAK激酶二聚体结构的解离激活机制，而是以单体形式发挥功能。关于PAK4的活化方式，比较认同的是PAK4在调控结构域中新定义一个假底物序列（pseudosubstrate sequenee，PS），尚未活化的PAK4结构域能够识别PS中的RPKP序列。PS是一个富含脯氨酸的区域，所以其可与含SH结构域的蛋白相互作用，当细胞分裂周期蛋白 42（cell division cycle 42，CDC42）与 PAK4的GTP酶结合域（GTPase-binding domain，GBD）结合后，将PAK4带到含有其他活性蛋白和基质的区域，从而使PS与包含SH蛋白的结构域结合，破坏激酶结构域与PS的关系，以此来激活PAK4。

1.2 PAK4作用机制

蛋白激酶PAK4是Rho家族鸟苷三磷酸酶（Rho-GTPase）Cdc42和Rac1下游主要的靶蛋白，参与细胞生长代谢、细胞骨架变化等许多重要的细胞活动。PAK4是PAK家族中最重要的一员，于筛选Rac和Cdc42的效应物时首次被发现，族中的每一个成员都可以独自地激活蛋白酶。PAK4对雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）的激活途径有作用，MTOR对控制细胞生长和代谢非常重要。当PAK4在细胞内过表达时，Rictor被激活。Rictor是雷帕霉素靶蛋白复合物2（mechanistic target of rapamycin kinase complex 2，mTORC2）的组成部分，mTORC2是由丝氨酸/苏氨酸激酶MTOR4形成的复合物之一。PAK4还可以调节肌动蛋白的翻译修饰过程，进而影响细胞骨架的实时变化。此外，PAK4还可以通过抑制caspase起始因子来抑制细胞的凋亡。

1.2.1 PAK4的上游作用机制 关于PAK4的上游作用机制并不多，现有研究结果显示，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）激活PAK4，反过来，PAK4可以调节HGF的下游靶蛋白——肌动蛋白的生成。另有研究表明，PAK4在宫颈癌中的高表达与其预后不良密切相关。研究发现，miRNA-214-5p是脊椎动物特异性的miRNA前体家族，上调miRNA-214-5p的表达能明显降低HeLa细胞中

PAK4

基因的表达水平，下调miRNA-214-5p的表达能明显增加HeLa细胞

PAK4

基因的表达水平，提示miRNA-214-5p可能会靶向调控

PAK4

的表达，生物信息预测发现miRNA-214-5p基因序列上存在连续的

PAK4

结合位点，荧光素酶实验也进一步表明

PAK4

能靶向结合miRNA-214-5p，这表明

PAK4

是miRNA-214-5p的下游靶标之一。1.2.2 PAK4的下游作用机制 PAK4的下游靶蛋白包括膜型基质金属蛋白酶（membrane type matrix metalloproteinase，MTMMP）1、LIM 激酶（LIM kinase 1，LIMK1）、鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide-exchange factor，GEF）H1、弹弓蛋白（sligshot，SSH）、RHo蛋白等。LIMK1可进一步激活Cofilin，或者使其磷酸化，进而调节细胞骨架的重组，参与肿瘤血管再生、细胞迁移等生物学行为。同时，其他研究也发现

PAK4

能够与miRNA结合，并且通过对miRNA的调控促进Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）信号通路的高度活化。在不同肿瘤中，PAK4可以通过不同的方式促进恶性肿瘤的细胞分裂、演进及扩散。比如在人乳腺癌细胞中，PAK4通过泛素-蛋白酶体通路，降低细胞周期依赖激酶抑制子p57kip2表达，促进肿瘤细胞的增殖。同时，PAK4还可通过非依赖性激酶机制，抑制早期凋亡分子caspase 8，从而抑制细胞凋亡。

2 小分子抑制剂

近几年来，很多关于恶性肿瘤的报道均表明PAK4的高表达或过度活化是造成多种肿瘤恶化、扩散的主要诱因。PAK4在肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌细胞中的表达量远远高于正常细胞，其对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移均产生重要影响。大量细胞模型的培养分析结果显示，

PAK4

扩增与肿瘤细胞转移、细胞黏附性异常等多项有利于肿瘤进展的行为有着密切联系。PAK4作为一种有潜力的药物开发靶点，其抑制剂的开发为治疗相关的肿瘤提供了新思路。目前，PAK4的抑制剂数量很少，但多数抑制剂的活性并不理想，已经进入临床阶段的小分子抑制剂有PF-3758309、KPT-9274等，具有良好的PAK4抑制效果和药代动力学性质，但多数抑制剂仍处于实验室开发阶段，比如星形孢菌素等其他小分子抑制剂，虽有证据表明它们可抑制PAK活性，但却有药物动力学不稳定、生物特异性较低、选择性差等缺陷，无法将其应用于临床。下面将几个具有代表性的并且已经进行临床试验评估的小分子抑制剂进行简要介绍。

2.1 PF-3758309

PF-3758309是一种有效的PAK抑制剂，具有较强的抗癌作用，如抑制肿瘤细胞异常分裂、诱导肿瘤细胞凋亡等。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）可将肿瘤细胞固定于特定位置，ECM主要成分为明胶、胶原和层粘连蛋白等，PF-3758309可抑制水解ECM的酶，如MMP2和MMP9。现有研究表明，MMP2的表达在卵巢肿瘤细胞中因PAK4诱导的细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2失活而下调。有研究结果表明，PF-3758309可通过该机制抑制PAK4的活性进而抑制肿瘤细胞的转移。但进入临床研究（NCT00932126）发现，PF-3758309的生物利用度低、药动学性质差、不良反应大，可引发患者4级中性粒细胞减少以及胃肠系统不良反应等，暂时无法应用于临床治疗。研究发现，PF-3758309在动物实验和细胞试验中均可以与抗肿瘤药物（包括吉他西滨）联合用药，抑制细胞增殖，最大程度地抑制肿瘤细胞增殖，同时研究还表明，PF-3758309和吉他西滨联合用药与白蛋白结合型紫杉醇联合吉他西滨作用相当。能否通过改变结构或与其他药物联合用药等手段将该抑制剂应用于人体，从而改善其药物动力学差、不良反应多等缺点，并投入临床是将来一个重要的研究方向。

2.2 KPT-9274

KPT-9274是PAK4和烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phospho-ribosyltransferase，NAMPT）的双重特异性抑制剂。研究表明，Rictor是在KPT-9274处理的细胞中被抑制的重要靶标，而PAK4在Rictor的调节中起正性作用。Rictor是MTORC2的一个成分，mTORC2是丝氨酸/苏氨酸激酶MTOR形成的复合物之一。KPT-9274化合物可以通过抑制PAK4活性，进而影响mTORC2信号来阻断乳腺癌细胞的生长。同时，有研究表明，该抑制剂可以特异性抑制胶质母细胞瘤的内皮细胞的增殖，但不会抑制正常大脑内皮细胞的增殖，同时可修复肿瘤微环境，重构整个血管微环境。上述研究结果肯定了它的临床应用价值，目前临床上大部分实体瘤都有血管异常的情况，说明KPT-9274还可应用于乳腺癌、胰腺癌等其他恶性肿瘤中。KPT-9274在体内具有良好的药代动力学特征，在小鼠中耐受良好，静脉注射或口服微量药物时，未发现不良反应。KPT-9274正在进行实体肿瘤和淋巴瘤的Ⅰ期临床试验评估，有望投入临床使用。

3 PAK4在部分恶性肿瘤中的生物学作用

3.1 胰腺癌

胰腺癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一，5年生存率低于10%。研究表明，胰腺癌组织中发现

PAK4

扩增，但并未明确具体的分子机制。Bi等的研究发现，长链非编码RNA LINC00657通过竞争miRNA-433的内源性RNA来增加PAK4的表达，从而加深胰腺导管腺癌的恶性程度，LINC00657可直接与miRNA-433相互作用，从而降低miRNA-433与

PAK4

mRNA的竞争结合，并最终增加PAK4表达。这同样证明了PAK4在胰腺癌恶变的过程中担任了重要角色，也为PAK4的靶向抑制寻找到了新的靶点——miRNA-433。近期，有科研团队在敲除

PAK4

的大鼠体内建立胰腺癌模型，结果证明，敲除

PAK4

明显提高了携带胰腺癌大鼠的成活率，更加确定了PAK4可以作为胰腺癌的潜在治疗靶点。但胰腺癌与PAK4之间具体的分子机制仍未阐明，这也将是今后一个重点的研究方向。在胰腺癌的肿瘤学研究中，还发现90%以上胰腺癌会出现大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）突变，肿瘤细胞可激活

RAS

基因，激活的

RAS

基因使正常细胞经历自然衰老的过程，细胞衰老会产生明显的生长阻滞，从而有效预防肿瘤的发生。而PAK4的过表达可能会克服

RAS

突变诱导的细胞衰老，进而造成多种肿瘤发生恶变。上述研究提供了以检测

PAK4

过表达为基础，靶向诱导

RAS

突变治疗胰腺癌的新策略。

3.2 胃癌

胃癌是人类常见的消化系统恶性肿瘤，2018年全球恶性肿瘤发病率统计中，胃癌发病率居第五位，病死率居第三位。PAK4高表达在胃癌的肿瘤进展、转移过程中发挥重要作用。在众多信号通路中，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路的失调在胃癌的肿瘤进展中扮演着重要的角色，活化的TGF-β可进一步活化Smad复合物，TGF-β失调会导致Smad表达的抑制，进而加重胃底细胞的不正常增殖，研究发现PAK4与Smad2/3相互作用，通过使Smad2/3磷酸化，导致TGF-β1信号通路失调，从而使胃癌细胞逃脱TGF-β介导的生长抑制，这可能会导致胃癌的发生。

研究表明，PAK4还可通过LIMK1/Cofilin信号通路来减慢胃癌细胞侵袭的速度，同时PAK4的过表达还将促进胃癌细胞的增殖。研究结果显示，miRNA-199a/b-3p通过抑制PAK4的过表达，来抑制胃癌细胞的恶性增殖，这无疑又为PAK4的靶向抑制剂提供了一个新思路。

研究显示，PAK4活化丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和 PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）通路对顺铂治疗胃癌作用产生抵抗，且PAK4与PI3K/AKT通路存在相互激活的作用，即PAK4对顺铂的耐药性起到关键性作用。因此，以PAK4为目标靶点，用相关PAK4抑制剂与顺铂联合用药，或许可以获得更好的临床效果。

3.3 肺癌

肺癌是人类肿瘤死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的类型，占所有肺癌患者的80%以上。研究表明，PAK4在NSCLC中存在过表达现象，PAK4介导的LIMK1磷酸化可以调控NSCLC的转移和侵袭，由此推测PAK4可能是NSCLC重要的潜在治疗分子靶点。

缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧诱导而产生的细胞内特异性DNA结合蛋白，但在正常条件下，HIF-1α在肿瘤细胞中也高表达。近期研究表明，在NSCLC中HIF-1α阳性率升高，该蛋白与NSCLC转移、复发相关，是患者不良预后的重要指征。而HIF-1α的翻译需要PAK4依赖的PI3K/AKT通路刺激，这也强有力地说明了PAK4与NSCLC的密切关系。

3.4 乳腺癌

乳腺癌是全球发病率较高的恶性肿瘤，也是严重威胁中国女性身体健康的恶性肿瘤之一。研究发现，PAK4与乳腺癌有着极为紧密的联系。Rane等发现PAK4在乳腺癌中表达水平较正常组织明显上调，且与淋巴结转移、组织分化程度、肿瘤直径密切相关。

PAK4

mRNA高水平表达的乳腺癌患者的无病生存期（disease-free survival，DFS）较差，说明PAK4在乳腺癌的发病以及治疗过程中承担着重要的角色。

对于PAK4与乳腺癌的关系，近几年也有了新发现。研究表明，PAK4虽然不直接导致肿瘤细胞的凋亡，但可通过其他信号通路抑制肿瘤细胞。当PAK4受到抑制时，RELB表达增高，RELB是核因子（nuclear factor，NF）-κB的重要亚基，通过结合DNA，使转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT enhancer binding protein，C/EBP）β水平升高，最终阻滞肿瘤细胞生长。同时还有研究发现，PAK4介导的C/EBPβ激活还可以提高紧密连接蛋白 4（claudin-4，CLDN4）表达，从而促进乳腺癌细胞的转移和侵袭，这表明抑制PAK4-C/EBPβ-CLDN4轴可能是治疗乳腺癌的新途径。

3.5 肝细胞癌

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国最常见的恶性肿瘤之一，病死率居第三位。PAK4可以促进p53磷酸化，抑制p53转录活性并促进HCC的增殖转移。相关报道发现，miRNA-369-5p在HCC中可以定向抑制PAK4的表达，进而抑制HCC细胞在人体内增殖、侵袭以及转移，也间接证实了PAK4可导致HCC的发展，这也为PAK4的靶向抑制剂的研究提供了一个新型靶点。

还有研究表明，可通过去除PAK4来阻断细胞周期、诱导细胞凋亡以达到抑制肝癌的目的，在肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）作用下去除PAK4导致NF-κB的存活信号被抑制，并触发了caspase 8的凋亡通路，这提示PAK4是TNF-α诱导的肝癌细胞caspase 8凋亡和NF-κB存活信号的转换靶点。

3.6 其他相关恶性肿瘤

食管癌是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，该肿瘤主要病理分型有两种，其中鳞状细胞癌占中国食管癌患者的90%以上。近期研究发现，与正常相邻组织和食管上皮细胞系相比，PAK4在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cancer，ESCC）组织和该肿瘤细胞系中显著高表达，PAK4通过与LASP1蛋白相互作用促进ESCC的进展，即PAK4可以促进ESCC细胞在人体内增殖、转移。该研究进一步证明了，PAK4可作为治疗ESCC的潜在靶点。

膀胱癌发病率居全球第九位，病死率也较高。膀胱癌依据组织分型可分为两种，非肌层浸润性膀胱癌（nonmuscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）。其中，MIBC的预后极差，即使做了根除性手术，患者术后生存率仅为60%。研究结果显示，PAK4在膀胱癌中存在扩增、过表达和激酶活性升高的现象，PAK4在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）细胞增殖和侵袭中发挥一定的作用。此外，PAK4可能对肿瘤中

PAK4

扩增或过表达的一部分MIBC患者具有治疗作用，这表明PAK4也可能成为MIBC的治疗位点之一。

4 小结与展望

由于PAK4在肿瘤发生、发展及多种细胞活动中的重要作用，其成为了肿瘤治疗中的一个重要靶蛋白，并且PAK4已经被证实在多种肿瘤进展中发挥着关键性作用，必将作为今后多种恶性肿瘤治疗的理想靶点。目前，越来越多结构新颖、特异性强的PKA4抑制剂出现，但仍处于临床前实验研究阶段，真正运用于临床的靶向抑制剂屈指可数，PAK4的深入研究也正处于起步的阶段。因此，深入研究PAK4可能会发现更多遏制恶性肿瘤增殖、扩散的有效治疗策略。