白藜芦醇诱导癌细胞衰老机制的研究进展

马凤秋，高俊英，李国荣，谢英渤

(山东师范大学生命科学学院，山东济南 250014)

癌症是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，大多数癌症患者在经过一段时间的化疗和放疗后，除了产生致命的副作用外，还会对化疗和放疗产生耐药性。细胞衰老是由应激引起的细胞周期阻滞状态，通过诱导癌细胞衰老来抑制癌细胞的无限增殖被认为是一种新的癌症治疗策略。在一些癌前病变和良性肿瘤(如黑素细胞痣、肺腺瘤和前列腺上皮内瘤等)中都发现了大量的衰老细胞，但在相应的肿瘤恶化阶段并未发现衰老细胞，表明细胞衰老可作为肿瘤发生的初始屏障[1-3]。2005年，Braig等[4]证明组蛋白甲基转移酶Suv39h1介导的细胞衰老抑制了小鼠淋巴瘤的形成。随后，在其他小鼠肿瘤模型(如HrasG12V诱导的乳腺癌和BRAFV600E诱导的肺癌)和多种人类癌症中，也证明了细胞衰老对肿瘤的抑制作用[5-6]。在三阴性乳腺癌细胞中，胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7, IGFBP7)通过诱导DNA合成前期/合成后期(G1/G2期)细胞周期阻滞，上调磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)及衰老相关蛋白p53、p21表达，诱导了癌细胞衰老并抑制了小鼠异种移植瘤的生长，而且IGFBP7的表达与乳腺癌进展和不良预后呈负相关[7-8]。一些化疗药物也通过诱导癌细胞衰老发挥抑癌功能，如：伊立替康和甲氨蝶呤通过促进脱氧核糖核酸(DNA)损伤诱导了结肠癌细胞等的衰老[9]；在肺癌患者中，卡铂和紫杉醇治疗促进了肺癌组织的衰老，抑制了肿瘤的生长[10]； 在乳腺癌患者中，蒽环类药物和烷基化剂显著上调了p16的表达，诱导了癌细胞衰老[11]。相比于诱导癌细胞凋亡，诱导癌细胞衰老治疗剂量更小，在前列腺癌细胞中，浓度为250 nmol/L的阿霉素会导致凋亡，而浓度为25 nmol/L的阿霉素会诱导衰老[12-13]。使用小剂量的药物对癌症患者进行长期促衰老治疗，能有效减少治疗引起的毒副作用和耐药性。

近年来，天然产物越来越多地用来预防和治疗癌症。白藜芦醇(又名芪三酚)是一种天然非黄酮类多酚化合物，存在于70多种植物中，如葡萄、虎杖、花生等，具有抗氧化、抗炎、保护心脏的功能[14]，在抑制癌症的发生、发展方面也显示出良好效果，且对正常细胞无明显毒性[15-16]。此外，白藜芦醇可以逆转癌细胞的多药耐药性，当与临床药物联合作用时，可以使癌细胞对标准化疗药物敏感[17-18]。体内外研究显示，白藜芦醇能够通过诱导癌细胞衰老发挥抑癌功能。本文中对细胞衰老的特征，以及白藜芦醇通过氧化应激、癌基因激活、DNA损伤和其他机制诱导的癌细胞衰老的研究进展进行综述。

1 细胞衰老的特征

细胞衰老是一种永久的细胞周期停滞状态，包括复制衰老(replicative senescence, RS)和应激诱导的衰老(stress-induced premature senescence, SIPS)2种类型[19]。RS主要由端粒的缩短和功能障碍导致；SIPS可由氧化应激、活化的癌基因、DNA损伤试剂等诱导[20-21]。衰老细胞具有独特的形态、结构和分子特征(见图1)。在形态上，细胞骨架的重新排列使得衰老细胞变得扁平，体积增大；在结构上，衰老细胞会形成衰老相关异染色质灶(senescence-associated heterochromatin foci, SAHF)，通过抑制增殖相关基因表达，帮助建立和维持细胞周期阻滞[22]。核纤层蛋白B1(lamin B1)通常在衰老细胞中减少，它与衰老引起的细胞核结构变化有关[23]；衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)是最常用的衰老细胞标志物，在衰老细胞的酸性溶酶体中SA-β-gal明显增多，但在其他非分裂细胞如静止细胞中缺乏高SA-β-gal活性[24]。细胞衰老通常还伴随着细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制剂(包括衰老相关蛋白p16INK4a、p21CIP1和p27)表达水平的增加，其中p16INK4a的表达是已知最可靠的衰老标记，基于p16INK4a启动子构建的报告基因已成功用于体内衰老细胞的检测[25]。衰老相关蛋白p19ARF、p53在衰老细胞中表达增强，也可作为相关衰老生物标志物[23]。衰老细胞通常还表现为凋亡抗性，这可能与抗凋亡蛋白BCL2的高表达或p53的失活相关[26-27]。衰老细胞虽然丧失了增殖能力，但其代谢仍然非常活跃，可分泌炎性因子、趋化因子、细胞外基质蛋白酶和生长因子，称之为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)。SASP是衰老细胞病理功能的关键介质，可以通过旁分泌加速邻近细胞的衰老[28]。

图1 细胞衰老的特征

2 白藜芦醇诱导癌细胞衰老的机制

2.1 氧化应激诱导的衰老

氧化应激理论由自由基理论发展而来，是促进细胞衰老最经典的机制之一。其中，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的过量产生或清除不足引起的氧化应激是介导细胞衰老的主要因素。在人成纤维细胞中，外源性过氧化氢(H2O2)通过不可逆的细胞周期阻滞诱导了细胞衰老[29]。使用活性氧清除剂、过氧化氢酶或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-1(NADPH oxidases 1, Nox1)的小干扰核糖核酸(siRNA)处理人主动脉血管平滑肌细胞后，抑制了由血管紧张素Ⅱ诱导的衰老[30]。

在正常细胞和器官中，白藜芦醇通过抑制氧化应激延缓衰老，减少年龄相关性疾病(如癌症)的发生。Liang等[31]研究显示，白藜芦醇通过降低细胞内ROS水平和改善线粒体功能增强了小鼠卵母细胞对衰老的抵抗力。在D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型中，白藜芦醇处理抑制了心肌细胞和脑神经细胞的ROS水平，增强了肝脏抗氧化酶活性，从而提高了衰老小鼠心脏、脑和肝脏的器官指数[32]，而在癌细胞中，白藜芦醇通过促进氧化应激诱导癌细胞衰老，从而发挥抑癌作用。白藜芦醇长期处理导致结肠癌细胞HCT116呈现衰老样生长停滞，这依赖于ROS诱导的p38MAPK、p53、p21的上调[33]。Luo等[34]发现白藜芦醇通过上调Nox5的表达增加ROS水平，从而诱导肺癌细胞的衰老。在癌细胞U2OS和A549中，白藜芦醇以剂量依赖的方式诱导DNA合成期(S期)阻滞，促进ROS产生，增加SA-β-gal表达[35]。

电离辐射(ionizing radiation, IR)也是诱导癌细胞衰老的一种重要方式。白藜芦醇联合IR处理肺癌细胞后的SA-β-gal阳性细胞比例明显高于白藜芦醇或IR单独处理的，白藜芦醇诱导的放射增敏与ROS的生成有关，抑制ROS的产生能够减弱白藜芦醇对肺癌细胞的辐射敏感性[36]。本课题组之前的研究显示，白藜芦醇处理癌细胞MDA-MB-231、MCF-7、H1299后，线粒体相关因子MT-ND1、MT-ND6、ATPase8、PGC-1α表达下调，ROS水平增高，衰老相关蛋白p21、p27等表达上调，SA-β-gal阳性染色增加[37]。在个体水平上，白藜芦醇通过上调抗氧化酶活性，下调ROS和氧化损伤水平，延长了一年生鱼贡氏假鳃鳉的寿命，并且抑制了其肝脏中自发性肿瘤的发生[38-39]。白藜芦醇的抗氧化或促氧化特性及其对细胞衰老的生物学影响，可能因细胞和组织类型及特定环境而异，仍需进一步的研究。

2.2 癌基因诱导的衰老

1997年的一项研究发现，致癌基因ras通过激活p53或p16/视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)信号通路来诱导鼠或人成纤维细胞衰老[40]，被称为癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence, OIS)。其他致癌基因如BRAF、Akt等的激活以及抑癌基因PTEN等的失活，也可诱发OIS[41]。C-X-C趋化因子受体2(C-X-C chemokine receptor 2, CXCR2)可正向调控OIS，白藜芦醇能以时间依赖的方式显著增加CXCR2转录水平，CXCR2的表达促进了癌细胞衰老[35, 42]。在OIS期间白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)表达上调，而缺失IL-6则使细胞重新进入细胞周期，恢复增殖并伴随着SAHF形成减少CDK抑制剂p15INK4B表达下调[43]。肝癌缺失因子1(deleted in liver cancer 1,DLC1)是一种抑癌基因，其表达经常因基因缺失或异常启动子甲基化在多种癌症类型中失活或下调[44-45]。在肺癌和乳腺癌细胞中，白藜芦醇显著上调IL-6和DLC1的表达，并以DLC1依赖的方式诱导癌细胞衰老[37]。白藜芦醇诱导了非小细胞肺癌的衰老，并伴随着p-AKT表达的下调[36]。POZ/BTB与Krüppel(POK)家族中的成员POK红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid ontogenic factor,Pokemon)，在胶质瘤细胞系U87MG、T98G、U251和原发性胶质母细胞瘤细胞中高表达，白藜芦醇通过降低胶质瘤细胞中Pokemon启动子活性和Pokemon表达，诱导细胞凋亡和衰老从而抑制癌细胞增殖[46]。

2.3 DNA损伤诱导的衰老

DNA损伤是细胞衰老的主要原因之一。当发生DNA单链或双链断裂时会触发DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)，DDR由DNA损伤蛋白传感器如Mre-Rad50-Nbs-1(MRN)复合物介导，触发共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia mutated, ATM)和共济失调毛细血管扩张Rad相关(ataxia telangiectasia and Rad3-related, ATR)蛋白激酶，细胞周期检测点激酶1、激酶2(CHK1、CHK2)信号传导系统，最终，DDR激活p53，p53通过转录激活其下游p21等靶点，促进细胞凋亡或衰老[47-48]。ATM、ATR在Ser139位点磷酸化组蛋白H2AX (γ-H2AX)，γ-H2AX常作为DNA双链断裂的标志，可以与复合物Rad51、BRCA1、53BP1、MRN等共定位于DNA断裂处，参与DNA损伤修复[49-50]。

白藜芦醇在DNA损伤诱导的癌细胞衰老中发挥重要作用。在骨肉瘤细胞中，白藜芦醇通过上调ATM、CHK2诱导G2/细胞分裂期(M期)阻滞[51]；在结肠癌细胞中，白藜芦醇诱导了瞬时的S期阻滞，激活了ATM/CHK1/细胞分裂周期2(cdc2)信号通路，上调了γ-H2AX、p-p53和p21的表达，并以ATM依赖的方式增加SA-β-gal阳性染色[33]。在前列腺癌细胞中，白藜芦醇通过上调促凋亡分子Fas和TRAILR1促进了放射治疗诱导的凋亡，也通过上调γ-H2AX促进了放射治疗诱导的衰老[52]。Rad9蛋白是DDR的关键分子之一，具有肿瘤抑制作用，在MDA-MB-231和H1299细胞中，异位表达Rad9通过上调p21诱导了癌细胞衰老[53]。利用浓度为10～50 μmol/L的白藜芦醇处理MCF-7和A549细胞后，SA-β-gal和γ-H2AX阳性染色细胞数量显著增加，Rad9在转录和翻译水平上的表达均增加，p53和p21表达上调，而用siRNA敲低Rad9后，显著抑制了白藜芦醇的上述作用[54]。白藜芦醇诱导了肺癌细胞H460衰老，同时上调了p-CHK2、p53、p-p53的表达[36]。Ji等[37]研究显示，小剂量白藜芦醇(浓度为20 μmol/L)处理7 d或大剂量白藜芦醇(浓度为100 μmol/L)处理1 d均显著诱导了肺癌和乳腺癌细胞衰老，并且伴随着p-CHK1表达上调。白藜芦醇通过下调Rad51、Nbs-1、Mre-11、Rad50水平，维持γ-H2AX表达来阻止DNA损伤修复，从而增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性[55]。Rusin等[56]研究显示，白藜芦醇诱导的骨肉瘤细胞衰老样生长抑制与BRCA1的上调相关。单泛素化的组蛋白H2B(mono-ubiquitination of histone H2B, uH2B)可以直接富集在DNA双链断裂区，参与DNA损伤修复[57]，大剂量白藜芦醇短期处理(浓度为500 μmol/L，时间为4 h)可显著抑制乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、脑肿癌细胞中uH2B水平，小剂量白藜芦醇长时间处理(浓度为10～60 μmol/L，时间为9 d)通过下调uH2B将纺锤形胶质瘤细胞转化为增大的、不规则的扁平细胞并表达SA-β-gal[58]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)在多种癌症中高表达，抑制HDAC减弱了癌细胞的DNA损伤修复能力，增强了癌细胞对放射治疗的敏感性[59-60]。在神经胶质瘤细胞中，白藜芦醇增强了HDAC抑制剂丁酸钠的促衰老作用[61]。

2.4 其他机制诱导的衰老

白藜芦醇介导的癌细胞衰老还与Rictor和SIRT1相关。Rictor是哺乳动物雷帕霉素靶复合物2(mTORC2)的一个组成部分，在人表皮样癌细胞A431中，白藜芦醇下调Rictor表达，导致Ras同系物家族成员A-鸟苷三磷酸酶(RhoA-GTPase)活性降低、肌动蛋白细胞骨架组织异常和自噬溶酶体形成受阻，从而抑制自噬过程诱导癌细胞衰老[62]。SIRT1是一种Ⅲ类烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶，在多种肿瘤模型中SIRT1可作为白藜芦醇的关键靶点[15, 37]。在胃癌细胞AGS和MKN-45中，白藜芦醇通过上调SIRT1诱导癌细胞衰老[63]。在胃癌细胞BGC-823和SGC-7901中，白藜芦醇通过SIRT1介导的G1期阻滞、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)、CDK4、CDK6、p21和p16表达失调，诱导癌细胞衰老。白藜芦醇对胃癌的抑制作用也在体内得到验证。白藜芦醇(每千克体质量每日剂量为40 mg)显著降低了裸鼠肿瘤中细胞增殖标记物ki67阳性染色，增加了SA-β-gal阳性细胞比例，SIRT1的缺失则显著减弱了白藜芦醇在体内和体外的抑增殖和促衰老作用[64]。

3 展望

在过去的20年中，许多研究试图找到细胞衰老与癌症之间的相关性，结果普遍认为诱导癌细胞衰老可作为一个重要的抗癌策略。作为一种天然多酚和植物抗毒素，白藜芦醇被认为是一种低毒、有效的抗癌化合物，可以通过调控氧化应激、癌基因激活和DNA损伤等相关信号通路诱导癌细胞衰老。关于白藜芦醇的抗癌机制，有待从以下几个方面进行深入探究：

1)白藜芦醇生物利用度低，在体内会被迅速代谢，很难在血液中维持有效的治疗水平，如何使其能在代谢前到达所需部位而发挥抗癌作用是一个重大的挑战，研发出生物利用度高、靶向性强的新型白藜芦醇将为癌症治疗带来新的希望。

2)白藜芦醇可以作为放射治疗或化学疗法增敏剂，与紫杉醇、替莫唑胺、辣椒素、阿霉素等联合使用提高它们的抗癌作用，但作用机制仍需深入研究。

3)关于白藜芦醇诱导癌细胞衰老的体内研究较少，利用更多的动物模型和临床试验来探究白藜芦醇促衰老的机制将为癌症治疗提供重要依据。

总之，白藜芦醇作为一种天然的抗癌化合物，在抗癌领域具有广阔的应用前景。