新型近红外BODIPY类荧光探针的合成及光谱性能

田 琪，卢俊瑞*，谢志强，卢博为，刘金彪

（1.天津理工大学化学化工学院，天津300384；2.南开大学化学学院，天津300071；3.天津大学化工学院，天津300072；4.天津瑞岭化工有限公司，天津300384）

荧光成像作为一种可视化观测技术在小分子检测方面得到了广泛应用。荧光探针是当今科学和医学等领域不可或缺的工具，用于临床诊断、生物化学、材料科学以及环境化学等方面。荧光探针的主要作用原理在于以荧光光谱为手段，通过受体与待测物之间的特异性结合，从而改变荧光基团结构，导致荧光光谱发生改变。通过观测这种前后变化就可实现对待测物质定性或定量分析。

许多荧光探针的合成可以提高光稳定性，并将发射波长调谐到红色或近红外区700~1 100 nm，以避免发射染料的光漂白，加强在荧光成像过程中穿透程度。近红外分子探针的荧光成像技术具有背景干扰低、对细胞损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度好等优点，展现了较好的应用前景。因此，近红外荧光染料在生物检测领域具有许多的优势[1-4]。

荧光探针种类繁多，如香豆素类、萘衍生物类、啡啶吖啶类、荧光素类、罗丹明类等，且均具有优良的性能。其中氟硼二吡咯（boron dipyrromethene，BODIPY）类荧光染料的优势较为突出[5]，其基本结构单元具有易于进行化学修饰、荧光量子产率高、摩尔消光系数高等优点[6]，越来越受到人们的关注。因为荧光探针具有较高的选择性、高灵敏度、良好的光学稳定性等优点，被广泛应用于生物标记、探针检测及生物成像。

本文合成出一种新型近红外BODIPY类荧光探针，通过克脑文盖尔（Knoevenagel）反应延长侧链，增强共轭效应，使化合物的荧光发射波长接近700 nm，具有优异的光化学性能，有潜力成为一种非常有应用前景的BODIPY类荧光探针。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

本实验所用仪器包括：FL-4500型荧光分光光度计（日本日立公司），UV-3310型紫外可见分光光度计（日本日立公司），BS223S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），德国Bruker 400 MHz型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波谱仪（德国Bruker公司），X-4型显微熔点仪（北京科仪电光仪器公司），温度计未经校正，Waters超高液相色谱高分辨质谱联用（UPLC-HRMS）仪，层析薄板（天津市江天统一科技有限公司）。

本实验所用试剂包括：三氟乙酸，三氟化硼乙醚，哌啶，2，4-二甲基吡咯（纯度98%，天津希恩思生化科技有限公司），三乙胺（分析纯，天津科威化工科技有限公司），溶剂CDCl3-d1，内标四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS），1H NMR，13C NMR。

1.2 实验过程

1.2.1 BODIPY-1的合成

新型BODIPY-1的合成路线如图1所示。取100 mL三口圆底烧瓶，加入3，5-二溴苯甲醛1 g（3.32 mmol），进行N2置换，避光，加入二氯甲烷（dichloromethane，DCM）和2，4-二甲基吡咯0.75 mL（7.30 mmol），室温搅拌10 min。随后加入0.05 mL三氟乙酸。每隔30 min进行薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）分析，待原料消失。除去氮气保护，加入用10 mL DCM溶解的0.83 g（3.65 mmol）2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（2，3-dichloro-5，6-dicyano-1，4-benzoquinone，DDQ），继续反应3 h。在冰浴条件下，加入10.20 mL三乙胺，继续搅拌20 min，缓慢滴加12.50 mL三氟化硼乙醚，待反应恢复室温后过夜。水洗，用二氯甲烷萃取，硅胶柱层析（CH2Cl2）得到橙红色固体0.52 g，收率为51%。

图1 新型BODIPY-1的合成路线Fig.1 Synthetic route of new BODIPY-1

1.2.2 BODIPY-2的合成

新型BODIPY-2的合成路线如图2所示。在100 mL单口圆底烧瓶中加入产物1物质0.50 g（1.04 mmol）、4-溴苯甲醛0.96 g（5.20 mmol）和对甲苯磺酸0.04 g（0.21 mmol），加入适量哌啶，加热至120℃，密闭条件下反应2 h。水洗，硅胶柱层析（CH2Cl2），得到紫黑色固体0.63 g，收率为74.3%。

图2 新型BODIPY-2的合成路线Fig.2 Synthetic route of new BODIPY-2

2 结果与讨论

2.1 反应条件探索

由于第一步合成BODIPY-1，该反应成熟，反应条件温和，收率稳定，所以着重针对Knoevenagel反应进行研究，分别针对反应物的反应温度、物料配比、反应时间等条件进行优化设计。首先，反应温度分别设为90℃、95℃、100℃、110℃、120℃、140℃。哌啶和甲苯高温易挥发，为了体系物料保持不变，不影响反应进程，因此体系为密闭环境。在物料配比1∶2∶2的条件下，密闭反应2 h，甲苯溶剂中反应副产物过多，经过优化除去甲苯，单独使用哌啶为溶剂，反应收率依次是28.9%、44.3%、57.9%、62.7%、74.3%、65.6%。实验结果显示，该反应在120℃时收率最高，则最佳反应温度为120℃。升高温度收率没有明显变化，且副产物增多。

针对反应的投配比进行优化，反应条件筛选如表1所示。投料比对反应收率的影响较大，当物料摩尔比为n（1）∶n（醛）=1∶2时，反应不完全，原料剩余。当物料摩尔比为n（1）∶n（醛）=1∶2.2时，反应收率提高，副产物较少。当物料摩尔比为n（1）∶n（醛）=1∶2.5时，反应收率降低，副产物逐渐增多。从经济的角度确定最佳摩尔比为n（1）∶n（醛）=1∶2.2。

另外，考察了时间对反应收率的影响，反应加热2 h为最佳反应时间，收率达到74.3%，延长反应时间收率无明显提高。因此，最终确定合成BODIPY-2的最佳反应条件为：哌啶作为溶剂，BODIPY-1与醛的当量比为n（1）∶n（醛）=1∶2.2，120℃反应2 h，如表1所示。

2.2 结构分析

由表2产物1，2的表征数据可知，以CDCl3作为氘代溶剂，化合物BODIPY-1，2经1H NMR进行了表征。通过化合物BODIPY-1和BODIPY-2两组氢谱的对比可知，在Knoevenagel反应后，化合物BODIPY-1在化学位移2.56上对应两个甲基的单峰消失，并且在芳香区出现两组氢，应为碳碳双键上的氢。由此可知，共轭结构已形成，从而确认化合物BODIPY-2的结构。

表2 产物1，2的表征数据Tab.2 Characterization data of products 1，2

2.3 BODIPY-1，2的紫外和荧光光谱的测定

将BODIPY-1，2溶解于氯仿中，配成浓度为50μM的氯仿溶液，进行紫外-可见吸收光谱和荧光光谱的测定，图3为BODIPY-1，2在氯仿中的紫外-可见吸收光谱图，图4为BODIPY-1，2在氯仿中的荧光光谱图。

图3 BODIPY-1，2在氯仿中的紫外-可见吸收光谱图Fig.3 UV-Vis absorption spectra of BOPDIPY-1，2 in chloroform

图4 BODIPY-1，2在氯仿中的荧光光谱图Fig.4 Fluorescence spectra of BOPDIPY-1，2 in chloroform

由图3可知，BODIPY-1在氯仿中的最大吸收波长λmax为487 nm，而BODIPY-2在氯仿中的最大吸收波长λmax为596 nm，出现明显的红移现象。从对实验现象的观察可知，固体外观的颜色从橙色红变成蓝紫色。

将BODIPY-1，2配制成浓度为50μM的氯仿溶液，进行荧光性质测试。由图4可知，BODIPY-1的发射波长为λEm=552 nm，BODIPY-2的发射波长为λEm=711 nm，光谱红移，接近红外区域。

3 结论

本文通过Knoevenagel反应对BODIPY类化合物进行修饰，延长侧链结构，合成了一种新型近红外的BODIPY类荧光探针，并进行了结构验证。利用紫外荧光测试，探究了探针的光谱性能，发现共轭效应增强，光谱红移。