枳壳橙皮苷提取工艺研究

任嘉瑜，范 娜，彭晓邦

（1.商洛学院健康管理学院，陕西商洛 726000； 2.陕西“四主体一联合”秦岭健康食品配料及核桃产业技术校企联合研究中心，陕西商洛 726000）

枳壳为芸香科植物酸橙（Citurs aurantiumL.）及其栽培变种的干燥未成熟果实，盛产于江西、福建、陕西等地，富含黄酮类、挥发油、生物碱及香豆素等多种生物活性物质，枳壳黄酮类物质主要包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和川橙皮素等[1-3]。其中橙皮苷具有抗菌消炎、抗肿瘤、降血压、抗过敏、降低胆固醇及改变体内酶活性等广泛的药理作用[3-6]。因此，本研究以商洛枳壳为研究对象，采用醇-碱提酸沉淀法，通过单因素和正交试验，对枳壳中橙皮苷提取工艺进行优化，以期为商洛枳壳的应用扩展、经济价值的提升及实现枳壳经济产业化提供一定技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

商洛枳壳，采自商洛市；芦丁橙皮苷对照品，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司：无水乙醇，氢氧化钠，盐酸等均为分析纯，购于天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂出品）、高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）、DHG-9132A电热恒温鼓风干燥箱（北京齐欣科学仪器有限公司）、H-2050R离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、755B紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造）。

1.3 试验设计

1.3.1 工艺流程

试验流程：枳壳→干燥粉碎→水浴提取→过滤→滤液→酸沉→离心→沉淀→干燥→定容→测吸光度。

1.3.2 操作要点

（1）干燥粉碎。将枳壳在50 ℃干燥恒重，粉碎成粉末状，每次称取10.0 g，加入锥形瓶中。

（2）水浴提取与过滤。向锥形瓶中加入不同浓度的pH为13的乙醇溶液，在恒温水浴锅中进行提取，分别控制时间t，温度T，然后静止冷却，过滤，弃去滤渣。

（3）酸沉。用2 mol/L HCl溶液调整滤液pH，直至pH为7，静置过夜。

（4）离心与干燥。将酸沉后的滤液用离心机在4 000 r/min，离心5 min，弃去上清液，取出沉淀，然后用无水乙醇清洗沉淀，直至清洗液无色，然后在70 ℃恒温干燥箱进行干燥，直至沉淀质量不再发生变化[7-8]。

（5）定容和测吸光度值。准确称取沉淀量为10 mg，用pH为13的碱性无水乙醇溶液完全溶解后，定容到100 mL的容量瓶中，在287 nm测定其吸光度值，并计算相应的橙皮苷提取率。

1.3.3 枳壳橙皮苷提取工艺优化

分别以乙醇浓度（50%、60%、70%、80%和90%）、料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10）、提取时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、提取温度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、 80 ℃和90 ℃）、提取次数（1、2、3、4和5）为主要因素，pH为13的碱性乙醇为提取剂，研究各因素对枳壳橙皮苷提取效果的影响，并根据单因素实验结果进行正交试验。

1.3.4 标准曲线的绘制

精密称取橙皮苷标准品10 mg，用pH为13碱性无水乙醇完全溶解，定容100 mL，得到浓度为100 μg/mL橙皮苷标准溶液。吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和6.0 mL标准溶液于10 mL试管中，用碱性乙醇稀释到相应的刻度线，在287 nm波长下测定不同浓度标准品吸光度值，以标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5 橙皮苷提取率的计算

橙皮苷提取率为提取的橙皮苷的质量与原料的质量（干重）之比，则提取率可由计算公式获得。计算公式：

式中：E-橙皮苷提取率；C-样品浓度（μg/mL）；N-样品稀释倍数；V-待测样液体积（mL）；M-原料的质量（g）。

2 结果与分析

2.1 橙皮苷标准曲线

橙皮苷标准曲线如图1所示，得到回归方程：y= 0.016 4x-0.002 5，相关系数R2=0.999，橙皮苷浓度在10～60 μg/mL范围内浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

图1 橙皮苷标准曲线

2.2 单因素试验结果分析

由图2知，随乙醇浓度的增大，橙皮苷提取率逐渐增加，当乙醇浓度为70%时，橙皮苷提取率达到最大。但继续增加乙醇浓度，橙皮苷提取率反而降低。这可能是由于随着乙醇浓度增大，不利于橙皮苷的溶出，从而使橙皮苷提取率下降。因此，确定乙醇浓度为70%。

图2 乙醇浓度对橙皮苷提取率影响

由图3可看出，随料液比的增大，橙皮苷提取率逐渐增加，当料液为1∶6时，橙皮苷提取率达到最大。但继续增加料液比，橙皮苷提取率反而降低。这可能是当料液比较小时，橙皮苷不能充分溶解，橙皮苷提取率较低，料液比过大时，相同温度条件下需加热更多液体，所以细胞内部升温缓慢，导致橙皮苷溶出缓慢，提取率降低。因此，确定料液比为1∶6。

图3 料液比对橙皮苷提取率影响

由图4可看出，随提取时间的延长，橙皮苷提取率逐渐增大，当提取时间为3 h时，橙皮苷提取率最大。但继续延长提取时间，橙皮苷提取率反而下降。这可能是因为提取 3 h时橙皮苷已充分溶解于溶剂中，当提取时间超过3 h，导致枳壳中其他醇溶性强、亲脂性强的杂质成分溶出，同时部分橙皮苷分解，导致橙皮苷提取率下降。因此，确定橙皮苷提取时间为3 h。

图4 提取时间对橙皮苷提取率的影响

由图5可看出，随提取温度升高，橙皮苷提取率逐渐增加，当提取温度70 ℃时，橙皮苷提取率达到最大。但继续升高温度，橙皮苷提取率逐渐下降。可能提取温度过高导致橙皮苷变性，胶状物质增加，同时，提取温度过高，导致溶剂蒸发过快，且温度继续升高，成品颜色发黑，溶出的非橙皮苷成分增多，导致橙皮苷的提取率下降。因此确定提取温度为70 ℃。

图5 提取温度对橙皮苷含量的影响

由图6可看出，随着提取次数的增加，橙皮苷提取率逐渐增加。但采用二次提取法提取效果增幅相对较高，之后增加提取次数，橙皮苷提取率变化并不明显，综合考虑提取时间和经济因素，确定提取次数为2次。

图6 提取次数对橙皮苷提取率的影响

2.3 正交试验结果分析

由单因素试验结果得出乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4个因素对橙皮苷提取率影响较大，因此采用正交试验设计法得出的正交因素及水平如表1所示。由表2中正交试验结果极差分析得出，对橙皮苷提取率影响顺序依次为A（乙醇浓度）＞B（料液比）＞C（提取时间）＞D（提取温度），因素D提取温度对橙皮苷提取率影响较小，且验证试验结果表明提取工艺为A2B2C3D2，平均提取率为5.76%，因此从经济成本考虑，选择水平1，最终确定最佳提取工艺组合为：A2B2C3D1，即乙醇浓度为70%，料液比为1∶6，提取时间为3.5 h，提取温度为65 ℃，橙皮苷提取率为5.72%。

表1 正交试验水平因素表

表2 正交试验结果表

3 结论

本研究以商洛枳壳为原料，通过单因素试验和正交试验，优化得到橙皮苷最佳提取工艺参数：乙醇浓度为70%、料液比为1∶6、提取时间为3.5 h、提取温度为65 ℃，采用二次提取法，橙皮苷提取率为5.72%，该方法提取工艺简单，重复性好，工艺稳定。

醇-碱提酸沉淀法主要是利用橙皮苷在碱性条件开环溶解进行提取，在酸性条件下闭环形成沉淀。本研究通过单因素和正交试验，对枳壳中橙皮苷提取工艺做了初步研究，较成功地提取得到了橙皮苷。本试验采用乙醇的碱性溶液进行提取，不但环保、节能，而且提取率相对较高，适合工业生产。研究结果表明商洛枳壳中含有丰富的橙皮苷生物活性物质，具有广阔的开发利用前景和价值。