高效液相色谱仪、酶标仪和快检仪检测 小麦中呕吐毒素的对比分析

陈 舟

（襄阳市公共检验检测中心，湖北襄阳 441000）

呕吐毒素，又名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生，是一种全球性的污染谷物的霉菌毒素之一，通常在小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物及其制品中最为常见。DON超标摄入会导致人畜厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时会导致组织坏死和内脏出血，甚至死亡[1]。正因为DON对人类的生命健康有很大的威胁，我国对小麦中的DON含量制定了严格的限量标准。

当前，我国检测机构针对小麦中的DON检测设备有很多种，但涉及检测原理主要有串联质谱法、高效液相色谱法、薄层色谱测定法、酶联免疫吸附筛查法、胶体金纸层析免疫法等。在DON检测中根据不同的需求，选择不同的设备和方法来检测，对于检测效率至关重要，因此，本文通过实验对高效液相色谱仪、酶标仪、真菌毒素快速检测仪3种设备检测小麦中DON的优劣进行对比分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器，岛津；Model-680酶标仪，美国伯乐；ROSA-M快检仪，美国CHARM；TLE204E/02电子天平，梅特勒-托利多；PHC-11D氮吹仪，月旭科技（上海）；HY-4振荡器，金坛市大地自动化仪器；800D离心机，常州普天仪器；DON免疫亲和柱，安谱（CNW）；Deoxynivalenol标准品，安谱（ANPEL）；DON检测试剂盒，芬德生物（SZ FINDE）；ROSA DON快检试剂条，美国CHARM。

DON质控样-1、DON质控样-2，国家粮食和物资储备局科学研究院；甲醇（色谱纯）；聚乙二醇（生化试剂）；氯化钠（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；磷酸二氢钾（分析纯）；氯化钾（分析纯）；盐酸（优级纯）；去离子水。

1.2 样品前处理

1.2.1 高效液相色谱仪

称取25 g样品于100 mL具塞三角瓶，加5 g聚乙二醇，加水100 mL，混匀，振荡20 min。以玻璃纤维滤纸过滤至澄清，移取滤液2.0 mL，以1滴/s流速过免疫亲和柱，再分别用5 mL PBS缓冲盐溶液和水先后淋洗，弃去流出液，抽干小柱。加2 mL甲醇洗脱亲和柱，下滴速度1滴/s，收集洗脱液，50 ℃下氮气缓缓吹至近干，最后加入1.0 mL初始流动相，涡旋30 s溶解，0.45 μm滤膜过滤，取滤液入进样小瓶待上机检测。

1.2.2 酶标仪

称取5.0 g粉碎样品于50 mL离心管，加入20 mL去离子水，振荡5 min，室温4 000 r/min离心10 min；静置分层，取0.1 mL上清液，加入0.9 mL复溶液，混匀，待测。

1.2.3 DON快速检测仪

准确称量5.0 g粉碎样品于50 mL的离心管，加入25 mL 的去离子水，涡旋振荡1 min，静置1 min，取1 000 μL上清液于1号离心管中，放入离心机5 000 r/ min，离心1 min后，从中取100 μL样品提取液和1 000 μL呕吐毒素稀释缓冲液（DONQ）放入2号离心管，涡旋振荡10 s，待测。

1.3 上机检测

1.3.1 高效液相色谱仪

高效液相色谱仪设置紫外检测器，色谱柱：XB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm），其余色谱条件参考GB 5009.111—2016[2]。

1.3.2 酶标仪

加标准品和样品50 μL/孔到对应微孔中，然后加抗体工作液50 μL/孔，轻轻震荡5 s混匀，37 ℃避光反应30 min。 洗板：甩干孔中液体，用工作洗涤液350 μL/孔充分洗涤5次，每次间隔30 s，最后用吸水纸拍干。加酶标记物 100 μL/孔，37 ℃避光反应30 min。再次洗板（同上）。显色：加底物A 50 μL/孔，再加底物B 50 μL/孔，轻轻振荡5 min混匀，37 ℃避光显色15 min。终止：加入终止液50 μL/孔， 轻轻振荡混匀，终止反应。酶标仪于450 nm（建议双波长450/630 nm）处上机测定每孔OD值。

1.3.3 DON快速检测仪

读数仪调至DON-00档。取呕吐毒素快检试剂条（绿色），将其反面放入孵育器中，胶纸撕开至黑线处，取300 μL待测稀释液，缓慢加入试剂条凹槽中后盖上胶纸，45 ℃下孵育5 min后，插入读数仪测定读数。

1.4 仪器检测原理对比

（1）高效液相色谱仪（紫外检测器）。利用物质在色谱柱流动相与固定相之间有不同的分配量，进行DON分离，不同浓度的DON在紫外检测器引起不同响应值进而输出不同峰形，最后用外标法定量。

（2）酶标仪筛查原理。基于抗原抗体间接竞争反应技术，DON和酶标板上的预包被偶联抗原竞争抗呕吐毒素抗体，标记后用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含DON量成负相关，与标准曲线比较后得出具体值。

（3）DON快检测试仪检测原理。基于胶体金免疫层析技术，以胶体金作为示踪标志物，根据胶体金本身的显色特点来诊断特异性的待测物。

2 结果与分析

2.1 回收率与精密度、质控样精准度试验

在空白小麦样品中分别加入3组不同浓度的DON标准溶液，按照正常试验步骤进行前处理和检测，每个加标样品重复测定6次，测定其回收率和精密度，结果见表1。由表1可知，3种设备检测方法的回收率和精密度均达标[3]。在低浓度检测时高效液相色谱仪回收率略显偏低，可能由于其方法前处理相对复杂，造成一定的DON损失。精密度方面，高效液相色谱仪精密度最高，稳定性最好。

表1 小麦样品中DON加标回收率与相对标准偏差试验结果

将两个不同浓度DON质控样，按照正常试验步骤进行前处理和检测，每个浓度做4个平行样，测定其准确度，结果见表2。从表2中可知高效液相色谱仪准确度最高，其次是酶标仪，快检仪准确度略显不足，尤其是高浓度检测时更明显。由于快检仪检测原理和胶体金纸试剂条制备工艺等原因，快检仪不适合做定量检测。另外经过多次试验得出，酶标仪在高通量样品检测时，由于抗体的交叉反应、稀释倍数及操作污染等因素影响，有出假阳性风险，故阳性试样需进一步验证[4]。

表2 三种设备测定小麦质控样品中DON含量试验结

2.2 3种设备的操作使用对比

对3种设备在单位样品检验时间、费用、操作等方面进行综合比较，结果见表3。从表3中可知，3种检测设备各有优劣，检测机构、企业或者检验人员可根据自身不同需求和环境、样品量等因素综合考量来选择最合适的设备进行检验。尤其是快检仪操作简便、灵敏度高，适合于样品的快速筛查，可满足我国粮食及饲料企业、政府职能监管部门等开展日常现场检验和监管抽查工作[5]。

表3 3种设备检测综合比较

3 结论

本文主要对高效液相色谱仪、酶标仪、真菌毒素快速检测仪检测小麦中呕吐毒素的操作过程和检测结果进行对比分析。

从操作过程看，高效液相色谱仪前处理最为复杂和关键，直接影响结果准确度，另外消耗试剂较多，易造成污染，主要操作为电脑软件，能自动连续处理样品，可用于科研和高质量检验，对人员能力有一定要求；酶标仪操作过程相对简单，所需耗材成本也较低，但因其配置试剂较多，操作暴露风险较大，有一定安全隐患，但能同时上机检测96个样品，单批次平均成本低，也可用于现场实验，人员操作易上手；快检仪操作最为简单，所用耗材也较少，检测过程比较安全，检测速度较快，人员水平要求较低。

从检测结果来看，3种设备回收率和精密度均符合要求，其中高效液相色谱仪精密度和准确度最高；酶标仪检测可能会出现假阳性，因此在其检测出阳性样品时，可用高效液相色谱仪进行复检确认；快速检测仪检测速度较快，但其定量检测准确度不高，比较适用于快速定性检测。

在实际应用中，3种设备可以相互配合使用，灵活运用各种设备优势来高效率完成工作。粮食企业单位在新粮收购、转运时可运用快速检测仪进行粮食DON指标快速筛查，检测机构在集中进行粮食品质分析时，可运用酶标仪进行高通量检测[6]，对以上两个设备筛检出的阳性批次可用高效液相色谱仪进行精准复核，提升检测效率。日常检验工作中，快检仪和酶标仪可为高效液相色谱仪提供辅助性检测，相互补充，取长补短，为精准高效检验呕吐毒素共同提供数据参考。