山茱萸环烯醚萜苷对快速老化小鼠行为学及病理学改变的影响

马登磊 李延峥,2 祝艳秋 李 林 张 兰*

(1. 首都医科大学宣武医院药学部 神经变性病教育部重点实验室 北京市神经药物工程研究中心，北京 100053； 2. 华北理工大学附属医院神经内科，河北唐山 063000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着年龄的增加，AD的患病率增高，其中65岁以上人群中AD的患病率约为5%，70岁以上为10%，80岁以上则高达30%[1]。老化对疾病的发生和进展影响很大，是AD发病最重要的危险因子。AD等神经退行性病变的发生和进展等多个过程均与衰老有关，通过延缓脑及机体的衰老而预防和治疗AD将可能减轻AD患者的患病负担[2]。

快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)是由京都大学在AKR/J系小鼠繁育过程中发现的具有快速老化特征的小鼠品系。SAMP8小鼠表现不可逆的快速老化，表现与老年人和AD患者类似的老化症状，例如寿命减低、记忆障碍、运动障碍、突触丢失、Aβ及tau蛋白病变等[3-4]。

传统中药山茱萸具有补益肝肾的作用。山茱萸环烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside, CIG)是山茱萸中的有效部位。笔者[5]的前期研究显示，CIG能够改善创伤性脑损伤模型大鼠的认知功能及tau蛋白磷酸化。此外，研究[6-7]显示CIG可以改善不同月龄的SAMP8小鼠的行为学表现及tau蛋白的过度磷酸化，以上结果提示CIG在老化及AD中的潜在价值。但是CIG在SAMP8小鼠上对AD相关的其他病理改变的药理作用尚未完全阐明。因此，本研究拟应用8月龄的SAMP8小鼠，进一步研究药物CIG对SAMP8小鼠脑内淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)代谢相关蛋白及突触相关蛋白的变化，从而进一步探明CIG在老化及AD治疗中的潜在价值和可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8月龄正常老化小鼠(senescence accelerated mouse/resistant 1,SAMR1)，雄性，24只；8月龄快速老化小鼠SAMP8，雄性，48只，购自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心，动物分级为无特定病原体级(SPF)。实验动物饲养于首都医科大学宣武医院实验动物室屏障系统中，自由进食进水，保持每日12 h/12 h光照周期控制，温度控制20～25 ℃。所有饲养条件及操作规范按首都医科大学宣武医院实验动物伦理委员会的要求进行,实验动物许可证号:0003474。

1.2 主要药品、试剂及仪器

CIG由宣武医院药物研究室自行研制，为中药山茱萸的有效部位。从山茱萸中提取和分离，获得CIG，纯度为70% (其中主要成分为莫诺苷和马钱苷)。实验中采用干粉剂量，溶解于0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)，制成药液应用。阳性药奥拉西坦胶囊(oxiracetam capsule)，石药集团欧意药业有限公司生产，国药准字H20031033。适应证：轻中度血管性痴呆、AD以及脑外伤等症引起的记忆与智能障碍。

淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)抗体(货号2452)，识别突触后致密物蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)抗体(货号3409)，GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗体(货号5174)，识别钙调素依赖蛋白激酶IIα286位点苏氨酸Thr磷酸化(phospho-calcium calmodulin dependent protein kinase IIα,p-CamkIIα)抗体(货号12716)：购自美国Cell Signaling Technology公司；识别可溶性淀粉样前体蛋白α(soluble amyloid procurer protein α,sAPPα )抗体(货号SIG-39139)：购自美国Covance公司；识别去整合素金属蛋白酶10 (a disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10) 抗体(货号A2726)，识别突触囊泡蛋白突触体素(synaptophysin)抗体(货号SAB4502906)：购自美国Sigma公司；识别β-淀粉样前体蛋白裂解酶(β-site APP cleaving enzyme,BACE-1 ) 抗体(货号ab2077)、识别胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)抗体(货号ab109538)、识别α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体R1亚基GluR1 (glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 1)抗体(货号ab31232)、识别钙调素依赖蛋白激酶(calcium calmodulin dependent protein kinase IIα,CamkIIα)抗体(货号ab22609)均购自美国Abcam公司。

小鼠红外自主活动仪，BA-2小鼠避暗实验箱：中国医学科学院药物研究所。Western blotting法电泳及电转设备：美国Bio-Rad公司。化学凝胶成像系统(Flour Chem HD2)：美国Protein Simple 公司。

1.3 动物分组及给药

8月龄SAMR1共24只，采用数字表法随机分为2组：SAMR1对照组，SAMR1+CIG低剂量组(100 mg/kg)，每组12只。8月龄SAMP8共48只，采用数字表法随机分为4组：SAMP8模型组、SAMP8+CIG低剂量组(100 mg/kg，M)、SAMP8+CIG高剂量组(200 mg/kg，H)、SAMP8+奥拉西坦组(360 mg/kg，Oxi)，每组12只。CIG灌胃给药每日1次，共2个月，至10月龄。SAMR1对照组、SAMP8模型组灌胃给予同体积生理盐水。

1.4 自主活动实验

在给药2个月后，应用自主活动测试仪对SAMP8小鼠进行自主活动测试。将小鼠放入自主活动箱内，盖上箱盖，让小鼠适应3 min后，使用电脑程序控制实验开始，箱体内的红外感应自动记录小鼠的活动，计数5 min内小鼠的自主活动次数。

1.5 避暗实验

避暗实验是利用啮齿类动物趋暗的特性而设计的检测被动回避记忆能力的行为学方法[8]。实验装置分为明暗两室，明室有灯照射，暗室底部有通电铜栅，两室间有小门连接。训练时将动物放置在明室，因其嗜暗的特性钻入暗室，此时动物接受电击获得记忆。记录小鼠在第2次训练24 h后首次进入暗室的时间(步入潜伏期)。

1.6 Western blotting法检测

每组4只小鼠，麻醉后取出脑，剥离出皮质组织，放入-80 ℃保存。皮质组织按照1∶10(mg∶mL)比例加入含有蛋白酶抑制剂的组织匀浆液，裂解后加入蛋白上样缓冲液，95 ℃加热变性蛋白。用BCA法对蛋白含量进行测定。取30～50 μg样品，10%(质量分数) SDS-PAGE凝胶电泳及电转，蛋白转印到PVDF膜上，5% (质量分数)TBST脱脂奶粉封闭，分别与一抗(1∶1 000)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或抗兔IgG抗体(二抗，1∶2 000) 孵育。加ECL发光液后，在化学发光系统中得到蛋白条带。用Multi Gauge V3.0软件对目的条带进行灰度分析和统计，与GAPDH灰度比值后得到蛋白相对表达。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 CIG对SAMP8小鼠行为学的影响

在给药2个月后对SAMP8小鼠进行行为学测试，观察CIG对模型小鼠衰老(自主活动)及认知功能(避暗试验)的影响。自主活动记录各种小鼠的自主活动次数，避暗试验记录小鼠在第2次训练24 h后首次进入暗室的时间(步入潜伏期)。实验结果显示，各组间小鼠的自主活动次数及步入潜伏期时长差异均有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，模型组小鼠的自主活动次数与对照组相比显著降低(P<0.01)，而灌胃给予CIG(100、200 mg/kg)能够显著增加SAMP8小鼠的自主活动次数(P<0.05)。模型组小鼠步入潜伏期显著降低(P<0.05)，而CIG(200 mg/kg) 给药组可以显著增加SAMP8小鼠的步入潜伏期(P<0.05，图1)。

图1 CIG对SAMP8小鼠自主活动及避暗实验的影响Fig.1 Effects of CIG on locomotor activity and step-in latencyA: quantitative analysis of the number of locomotor activities; B: quantitative analysis of the step-in latency. #P<0.05, ##P<0.01 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 groups. CIG: cornel iridoid glycoside; SAMR1: senescence accelerated mouse/resistant 1; SAMP8: senescence accelerated mouse/prone 8; Oxi: oxiracetam (360 mg/kg); CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg.

2.2 CIG对SAMP8小鼠皮质APP相关蛋白表达的影响

采用Western blotting法检测SAMP8小鼠APP、sAPPα 、ADAM10、BACE-1、IDE的表达。各组间SAMP8小鼠sAPPα、ADAM10、IDE表达浓度差异均有统计学意义(P<0.05)，而BACE-1、APP表达浓度差异无统计学意义(P>0.05)。两两比较结果显示，SAMP8小鼠皮质sAPPα、ADAM10和IDE的表达浓度显著低于SAMR1组(P<0.05)。CIG给药可以显著增加SAMP8小鼠皮质sAPPα、ADAM10和IDE的表达浓度(P<0.05，图2)。

图2 CIG对SAMP8小鼠皮质APP相关蛋白表达的影响Fig.2 Effects of CIG on the expression of APP related proteins in the cerebral cortex of SAMP8 miceA: representative images of the expression of APP, sAPPα, ADAM10, BACE1 and IDE in the cerebral cortex of mice; B: quantitative analysis of the Western blotting. GAPDH served as an internal loading control and the relative intensity in the SAMP8 model group was set as 1.0. #P<0.05 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 group. Sal: normal saline (vehicle); APP: β-amyloid precursor protein; sAPPα: soluble APPα fragment; ADAM10: a disintegrin and metalloproteinase 10 (α-secretase); BACE-1: β-site APP cleaving enzyme (β-secretase); IDE: insulin-degrading enzyme; CIG: cornel iridoid glycoside; SAMR1: senescence accelerated mouse/resistant 1; SAMP8: senescence accelerated mouse/prone 8; CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg.

2.3 CIG对SAMP8小鼠皮质突触相关蛋白的影响

各组间SAMP8小鼠大脑皮质synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα表达差异均有统计学意义(P<0.05)，而CaMKIIα表达差异无统计学意义(P>0.05)。两两比较结果显示，SAM8小鼠大脑皮质synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα的表达显著降低(P<0.05)。CIG给药可以显著增加SAMP8小鼠皮质synaptophysin、PSD-95、GluR1和p-CaMKIIα的表达(P<0.05，图3)。

图3 CIG对SAMP8小鼠皮质突触相关蛋白的影响Fig.3 Effects of CIG on the expression of synaptic plasticity-related proteins in the cerebral cortex of SAMP8 miceA： representative images of the expression of synaptophysin, PSD95, GluR1, phosphorylated CamKIIα and total CamKIIα in the cerebral cortex of mice; B: quantitative analysis of the Western blotting. #P<0.05 vs SAMR1 group; *P<0.05, **P<0.01 vs SAMP8 groups. Sal： normal saline (vehicle); PSD95： postsynaptic density protein 95; GluR1: AMPA receptor subunit 1; CamKIIα: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II α; p-CamKIIα: phosphorylated CamKIIα at Thr286; CIG: cornel iridoid glycoside; CIG(L): CIG 100 mg/kg; CIG(H): CIG 200 mg/kg; Oxi: oxiracetam (360 mg/kg).

3 讨论

SAMP8小鼠模型可以模拟由老化等多种因素引起的散发型AD的临床和病理表现。SAMP8小鼠的老化速度，尤其中枢神经系统的衰老速度，是SAMR1对照小鼠的近两倍[9]。在4月龄时，SAMP8小鼠就开始表现出认知功能的障碍，从7月龄开始SAMP8小鼠表现出跟年龄相关的运动障碍[3, 10]。本研究发现10月龄的SAMP8小鼠表现出明显的认知和运动功能的障碍，CIG给药可以显著改善10月龄SAMP8小鼠的认知功能和运动功能障碍，提示CIG在改善老化引起的AD中的药理作用。

APP的异常剪切和Aβ沉积是AD的发病机制和病理表现之一。自6月龄起，SAMP8小鼠即表现出来了年龄相关性的Aβ沉积[11]。病理性的Aβ片段由APP在β-位点剪切酶BACE1和γ-位点剪切酶共同作用下生成[12]。而在健康大脑中，APP主要的剪切途径是被α-位点剪切酶ADAM10作用，生成可溶性的APP片段sAPPα和C末端[13]。与之前的研究[14]结果一致，本研究中发现SAMP8小鼠脑内ADAM10和sAPPα的表达水平显著降低。研究[15]显示，通过增加ADAM10的表达水平进而降低脑内Aβ沉积可以显著改善SAMP8小鼠的病理表现和存活。本研究中，CIG可以显著增加SAMP8小鼠脑内ADAM10和sAPPα的水平，提示CIG可能通过增加APP在α-位点的剪切，进而减少Aβ片段的形成。此外，IDE作为Aβ的降解酶，其表达的增加也可以改善Aβ沉积引起的病理改变[16]。因此，本研究认为CIG可以通过增加ADAM10和IDE等代谢酶的表达，改善APP的剪切途径，减少Aβ的形成。本研究中发现BACE-1在该月龄SAMP8小鼠的脑内有增加的趋势，CIG给药有降低其表达的趋势，这提示BCAE-1也可能参与Aβ的形成。

突触是神经系统的基本单元，在神经元信号传递中发挥重要的作用。本研究采用Western blotting法检测了突触相关蛋白的表达，包括突触囊泡蛋白突触体素(synaptophysin)、突触后致密物蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)、GluR1、CaMKIIα及其在苏氨酸(Thr)286位点磷酸化(p-CaMKIIα)的表达。突触的可塑性参与学习和记忆形成的基本环节。Aβ片段聚集后可以产生毒性，可以损伤突触的形态和正常的功能[17]。因此，SAMP8小鼠的一个特征病理表现就是突触的丢失及突触相关蛋白表达的降低[18]。突触相关蛋白synaptophysin和PSD95参与囊泡的转运和神经递质的传递，其表达量的多少提示了突触的丢失情况[19]。GluR1是α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)R1亚基，AMPAR在突触可塑性及冲动传递中发挥重要的作用[20]。本研究发现，CIG可以增加SAMP8小鼠脑内synaptophysin、PSD95和GluR1的表达，提示CIG给药可以改善突触的丢失和功能。

本研究进一步探讨了CaMKIIα的表达及激活情况。CaMKIIα为神经元突触后致密成分中重要组分部分，是一种钙离子激活的酶，它作为一个兴奋转录偶联的介导因子在学习和记忆功能方面发挥重要作用[21]。CaMKIIα在激活后，苏氨酸(Thr)286位点发生磷酸化，参与神经突触的重塑、学习记忆增强等过程[22-23]。本研究中发现CIG明显增加p-CaMKIIα的表达，提示CIG可能增加了SAMP8小鼠脑内突触的重塑和突触可塑性。

综上，本研究提示CIG可能有利于治疗老化引起的认知障碍及AD样的病理改变。