罗勒挥发油包合物制备及抑菌活性研究

毛见智 ，刘晓会

（上海工程技术大学 化学化工学院，上海 201620）

罗勒(Ocimum basilicum L.)为唇形科罗勒属植物，又名九层塔、甜罗勒，主要分布于东半球热带地区，我国西南多个省区均有分布. 其药理作用主要表现为抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗血栓、抗消化道溃疡以及降糖、降脂等[1]. 罗勒全草具有强烈的芳香气味，为主要芳香油植物之一，其挥发油是一种淡黄至黄色透明液体，临床用于治疗心虚、房颤、动脉硬化、高血压、高血脂、头痛、咳嗽、腹泻等[2]， 对细菌和真菌均有较好地抑制作用[3].罗勒挥发油类成分性质不稳定，很容易变质失效，水溶性差. 本研究将罗勒挥发油制备成包合物，以防止挥发油挥散，增加其稳定性及水溶性，并进一步研究包合物的抗菌能力，从而为罗勒挥发油药理活性的进一步研究和开发提供实验依据，使丰富的罗勒资源得到更充分地利用和更好地开发.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

实验仪器：光学显微镜，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；恒温磁力搅拌器，巩义市科瑞仪器有限公司；TC-15套式恒温箱，海宁市新华医疗器械厂；紫外分光光度仪，上海元析仪器有限公司；Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司.

1.2 试剂

实验材料：挥发油(自制)，羟丙基-β-环糊精（上海源叶生物科技有限公司），蒸馏水，无水硫酸钠（阿拉丁试剂公司），大肠杆菌ATCC 8739、金黄色葡萄球菌B696和白色念珠菌Y167，购自上海工微所科技股份公司，由本实验室保存.

2 实验方法与流程

2.1 挥发油提取

挥发油提取采用水蒸气蒸馏法. 取50 g罗勒碎叶于1 L蒸馏烧瓶中；加入约400 mL蒸馏水，没过碎叶；将蒸馏烧瓶放入电热套中加热，接回流提取装置，蒸馏提取6～8 h；待挥发油收集器中不再有挥发油增加后停止加热[4−6]，将装置冷却至室温；从收集器中收取淡黄色油状液体，用无水硫酸钠干燥.

2.2 包合物制备

称取羟丙基-β-环糊精1 g，置于100 mL锥形瓶中；加入20 mL蒸馏水，加热溶解，制备饱和水溶液；转移至恒温磁力搅拌器中，搅拌过程逐滴加入0.25 mL挥发油(等量无水乙醇溶解)；在转速300 rpm/min、温度40 ℃下进行包合，包合时间为2 h；待其冷却至室温后，分次加入5 mL石油醚；用分液漏斗分液除去未包合的挥发油，下层液体冷冻干燥，即得罗勒挥发油-羟丙基-β-环糊精包合物，称量，最后得到0.66 g包合物.

2.3 含油量测定(紫外分光光度法)[7]

2.3.1 方法学考察

精密称取罗勒挥发油约0.05 g，置于10 mL的容量瓶中，加入无水乙醇定容、摇匀，再将溶液稀释100倍，即得所需的挥发油待测溶液. 再精密称取羟丙基-β-环糊精0.5 g，放入50 mL容量瓶中，加入无水乙醇定容、摇匀、过滤，取滤液稀释10倍，即得所需的环糊精待测溶液. 精密称取包合物约0.1 g，精密加入15 mL无水乙醇，超声30 min后过滤，将滤液转移至25 mL容量瓶中，加入无水乙醇定容、摇匀，再将溶液稀释10倍，即得所需的包合物待测溶液. 以无水乙醇溶液为空白对照，将所配置好的3种待测溶液于200～400 nm波长处进行全波长扫描. 扫描结果显示：挥发油、包合物提取液在波长为277 nm处均有最大吸收，吸收相似；而羟丙基-β-环糊精提取溶液在此处没有吸收，故羟丙基-β-环糊精并不干扰测定结果，因此选定277 nm为检测波长.

2.3.2 线性关系考察

精密称取约0.5 g的罗勒挥发油置于100 mL的容量瓶中，加无水乙醇定容至100 mL，摇匀，再从中吸取1 mL溶液置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容至50 mL，摇匀，并以此作为对照溶液. 另外再从100 mL的容量瓶中分别吸取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL溶液置于10 mL的容量瓶中，加无水乙醇定容后摇匀. 将对照溶液与这7种已配制好的溶液稀释75倍后，于检测波长277 nm处测定它们的吸光度（A），并以吸光度对挥发油的质量浓度（x）进行线性拟合.

最终吸光度对挥发油的质量浓度的线性拟合结果为y＝36 002x−0.023 5，r＝0.999 5. 根据结果可知，吸光度值在 6×10−6∼1.8×10−5g/mL的质量浓 度范围内呈现出良好的线性关系.

2.3.3 含油量测定

为进一步测定包合物的包合效果，需要对包合物的挥发油含量进行测定. 首先配制好20 mL质量分数60%的乙醇溶液备用. 精密称取包合物0.1 g，加入15 mL质量分数 60%的乙醇溶液溶解，超声30 min后过滤，取滤液于波长为277 nm下测定其吸光度，得到吸光度值为0.915 7. 代入拟合的线性方程可以得出对应的挥发油质量浓度为1.4×10−5g/mL. 由此计算出包合物的含油量、包合率、收率、含油率等，公式[8]为

将所得数据代入式（1）进行计算，结果见表1.

表 1 羟丙基-β-环糊精包合结果Table 1 Inclusion results of Hydroxypropyl- β- Cyclodextrin

2.3.4 精密度实验

从2.3.2节的对照液中精密吸取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL溶液置于10 mL容量瓶中，按照2.3.1节中的方法用无水乙醇定容，于检测波长277 nm处测定吸光度，重复5次. 最终得结果为0.075、0.077、0.074、0.078和0.075，平均值约为0.076. 测得其相对标准偏差（Relative Standard D eviation，RSD）为1.08%，表明实验仪器精密度良好.

2.3.5 重复性实验

精密称取0.1 g包合物，用15 mL无水乙醇溶液溶解，于277 nm检测波长下测定其吸光度，重复5次，最终得结果为1.884、1.885、1.903、1.898和1.900，平均值为1.894，测得其RSD为0.47%，表明 该方法重复性较好.

2.3.6 加样回收率实验

准确称取羟丙基-β-环糊精包合物约0.2 g，含油量已知，加入无水乙醇，超声30 min后过滤. 取滤液并分为3组，每组3份，再按照50%、100%、150%的比例分别将挥发油加入到溶液中. 将溶液于检测波长277 nm处测定吸光度值，3组吸光度值的平均值分别为1.330、1.805和2.030. 代入线性曲线中求出含油量，最后求出的加样回收率平均值为92.25%，RSD值为0.2%，结果显示，回收率与 RSD值均在允许范围内.

2 .4 包合物质量评价

2.4.1 显微镜观察法

在显微镜下观察羟丙基-β-环糊精、包合物和罗勒挥发油与羟丙基- β-环糊精的物理混合物，结果如图1所示. 由图可知，羟丙基-β-环糊精在显微镜下呈块状结晶；包合物为黑色粉末状物质，未见明显油渍；物理混合物为表面含有油渍的块状物质，细小油滴和结晶并存，表明其物相未发生改变，也未形成新物质，只是简单的物理混合.

图 1 显微成像图Fig. 1 Microscope image

2.4.2 薄层色谱法

精密称取约0.03 g的罗勒挥发油，加入3 mL的石油醚溶液溶解备用；称取0.05 g的环糊精，加入3 mL的石油醚溶液溶解备用. 另外再称取0.1 g的包合物两份：一份直接加入石油醚溶解备用；另一份用无水乙醇溶解之后超声、过滤、旋干，然后再用石油醚溶液复溶. 以正己烷∶乙酸乙酯=9∶1为展开剂，展开、晾干，喷以5%质量浓度的香草醛浓硫酸，烘干至斑点显色清晰，结果如图2所示.

图 2 薄层色谱图Fig. 2 TLC chromatogram of samples

2.5 抑菌圈实验

将受试菌种接种于固体培养基中，37 ℃下分别活化24 和48 h. 用接种环挑取活化后的菌苔置于生理盐水中，分别制成质量浓度105～106CFU/mL的菌悬液，备用. 将直径0.6 cm的无菌圆形滤纸片浸入质量浓度为944 mg·mL−1的包合物水溶液中备用. 取菌悬液100 μL均匀涂抹在培养基平皿表面，用无菌镊子将滤纸片贴在含菌平皿上，以羟丙基-β-环糊精水溶液为空白对照. 37 ℃下培养24 h，测定滤纸片的抑菌圈直径[9]，每个平皿重复3次，结果见表2.

表2 包合物抑菌圈直径Table 2 Inhibition zone of inclusion complex cm

2.6 最小抑菌浓度实验

在5 mL小试管中依次加入液体培养基1 mL，吐温80试剂（体积浓度10%）100 μL，菌悬液50 μL，分别添加不同体积的罗勒挥发油和羟丙基-β-环糊精包合物，每次添加时均充分震荡试管，于摇床中在37 ℃、180 rpm/min（白色念珠菌，28 ℃，180 rpm/min）条件下培养24 h后，观察试管内菌液澄清度的变化，将与空白培养基澄清度基本一致的质量浓度定义为最小抑菌浓度. 由结果可知，包合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度分别为3.79、8.58和3.79 mg/mL. 罗勒挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度分别为5、10和5 mg/mL.

3 结 语

本研究选择能极大提高水中溶解度的羟丙基-β -环糊精作为包合材料对挥发油进行包合. 实验中采用紫外分光光度法能快速、准确地对罗勒挥发油羟丙基-β-环糊精包合物进行含油量测定，实验结果显示包合率为2.82%，收率为53.23%，含油率为1.02%，含油量较之前报道有所提高[10]. 显微镜、薄层色谱法（TLC）和红外光谱表征显示包合物已成功形成，而且包合状态良好. 同时，该方法操作方便、仪器简单，对提高该制剂中挥发油的稳定性有着积极意义.

抑菌实验表明，包合物和罗勒挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有一定的抑菌活性，前者的最小抑菌质量浓度分别为3.79 、8.58 和3.79 mg/mL，后者的最小抑菌质量浓度分别为5、10和5 mg/mL. 包合物最小抑菌质量浓度比罗勒挥发油稍小，其可能的原因是复合材料充分溶解在生长培养基中，扩大了活性成分和微生物的接触面.