秦巴山区蜜环菌新菌株“陕蜜2009”选育研究

赵赟鑫，谢海彬，叶彦慧，马 昕，吴永波，解修超，邓百万

(1．汉中市科技资源统筹中心，陕西 汉中 723000；2．汉中市汉台区汉麓生物科技有限公司，陕西 汉中 723000；3．陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000)

蜜环菌(Armillariamellea)隶属于担子菌亚门(Basiaiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、白磨科(Tricholomataceae)、蜜环菌属(Armillaria)[1,2]，是名贵中药材猪苓和天麻的共生菌，天麻和猪苓的生长必须依靠蜜环菌为其提供营养[3,4]，1990年徐锦堂等研究发现天麻在生长过程中，种子的萌发必须依靠共生菌紫萁小菇的侵染才能萌发[5]，蜜环菌对种子的萌发有抑制作用，天麻种子萌发后蜜环菌取代紫萁小菇为天麻提供营养[6]。秦巴山区地理位置优越，蜜环菌种质资源和林木资源丰富，由于蜜环菌新品种选育过程复杂，周期较长等因素，导致生产中可以使用的蜜环菌品种较少。为选育蜜环菌新品种，保障天麻、猪苓栽培稳步发展，课题组通过研究不同蜜环菌菌株伴栽天麻的品种比较，选育出了“陕蜜2009”新品种，该品种适具有适应性强、伴生栽培天麻高产稳产的特性，已通过了陕西省农作物品种审定委员会办公室非主要农作物品种鉴定登记。

1 材料与方法

1.1 材料

从不同生态环境条件的天麻种植区采集蜜环菌资源进行分离纯化，获得资源菌株18个，以当地使用多年的京-234为对照(CK)，菌株具体来源见表1。

表1 菌株编号及来源

萌发菌为石斛小菇，由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供；天麻蒴果及种麻选自乌杆天麻和红杆天麻，由汉中植物研究所提供。

树棒采用青冈木，长度50 cm、直径6～10 cm，在树棒2～3面砍成鱼鳞口，每窝10～12根树棒；树枝长度3～5 cm，直径1～2 cm，每窝2.5 kg；树叶每窝0.5 kg；树棒和树叶在有性播种前用清水浸泡24 h，树枝用0.25% NH4NO3溶液浸泡30 min；无性栽培需提前培养好优质菌材，即采用长有蜜环菌的菌棒和菌枝。

1.2 方法

1.2.1 遗传特异性分析

1.2.1.1 DNA分子指纹 制备液体种，用CTAB法提DNA[7]；取40 mL TBE缓冲液、0.4 g琼脂糖，制备1%琼脂糖凝胶，加3 μL核酸染料，待其凝固；取5 μL 6×Loading Buffer 与5 μL DNA混匀；在1%琼脂糖凝胶中点样，常温下电泳，电压110 V，时间30 min，进行DNA的检测；利用ITS序列对真菌鉴定[8]，进行rDNA-ITS序列扩增；制备1%琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物5 μL点样，电泳时间1 h，在紫外成像仪上检测，将PCR扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司做双向测序。

1.2.1.2 蛋白质电泳 制备蜜环菌酶液和聚丙烯酰胺凝胶；采用Tris-Glycine系统电极缓冲液，pH 8.3，5.0%浓缩胶和10.0%分离胶，上样量20 μL，溴酚蓝指示剂1滴，上层加10%蔗糖5 μL，4℃下进行电泳；电泳初期电压80 V，样品进入分离胶后保持电压120 V，时间4 h；酶染色液使用坚牢蓝染色系统，电泳结束后将凝胶转移至染色液中，在恒温振荡器中37℃低转速下染色，等看到褐色的酯酶同工酶区带时，用水漂洗，保存，照相。

1.2.2 品种比较试验

1.2.2.1 有性栽培 采用室内箱栽法进行，料土按河沙与杂木屑的体积比1:1拌料均匀，选用65×40×45 cm塑料培养箱，底部铺有排水孔的塑料薄膜，填进料土10 cm，摆放一层湿树叶0.5 cm作为底叶，将拌过天麻种子的萌发菌叶均匀地撒在底叶上，取树棒紧压在播种层上，棒间距3～5 cm，将蜜环菌条夹放在两棒之间，菌枝空隙处放树枝数节，用料土覆盖3 cm，再按以上操作播第二层，播后盖料土10 cm，用湿树叶覆盖，将四周塑料薄膜拉起盖在箱面上。每箱用天麻蒴果10个，萌发菌1袋，蜜环菌2.5瓶，树棒10～12根，每个处理重复3次。室内管理过程中，温度控制在25℃以下，夏季最高不超过28℃；湿度控制在60%，冬季湿度在30%即可，管理期间不需要施肥和松土。生长期为8个月，产量统计以白麻和米麻的总重量来表示。

1.2.2.2 无性栽培 采用室内箱栽法，与有性栽培的区别在于没有播种层，取提前培养好的菌棒紧压在底叶上，棒间距6～8 cm，填半沟料土压实，将种麻紧靠在菌棒两头及两侧，每根菌棒放种麻8～10个，如有小米麻可撒在中间，在棒间空隙处斜放树枝数节，如菌棒发菌不旺，还可夹放蜜环菌菌枝，料土覆盖，棒面保持5～10 cm厚度，按上法再栽一层，栽完盖料土厚15～20 cm，用湿树叶覆盖，将四周塑料薄膜拉起盖在箱面上。按常规方法管理，8个月后统计产量，以白麻和米麻的总重量表示。

1.2.3 区域试验 2011-2012年度和2012-2013年度连续两个栽培季节在宁强县燕子砭镇、略阳县五龙洞镇、勉县张家河镇安排不同蜜环菌品种伴栽天麻试验，供试蜜环菌菌株为：ZY-17、ZY-5、ZY-9和ZY-7(CK)。栽培天麻品种为秦巴山区主产的红杆天麻，种麻为汉中植物研究所统一提供的零代种麻。每个试验点设置随机3个小区，每小区栽植天麻20窝，各试验点栽培管理措施一致，翌年冬季收获时调查统计各小区天麻产量，分析不同蜜环菌菌株对天麻栽培产量的影响。

1.2.4 生产试验 2013年～2015年在秦巴山区天麻主产区宁强、勉县、略阳、留坝、城固、南郑等地开展ZY-17伴栽天麻生产试验，以当地主栽品种“京234”为对照，对ZY-17伴栽红杆天麻、乌杆天麻的有性繁殖和无性繁殖进行生产试验和示范，检验新选育品种的丰产性、适应性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 遗传特异性分析

2.1.1 DNA及PCR电泳结果 图1结果显示，18株蜜环菌的PCR序列扩增片段大小都在500-750 bp范围。

注：M：DNA marker；1-18：ZY-1、 ZY-2、 ZY-3、 ZY-4、ZY-5、ZY-6 、ZY-7、

2.1.2 rDNA-ITS测序结果及两两比较 用Editseq软件对碱基长度、GC含量进行测量，结果如表2。rDNA-ITS碱基片段长度和DNA序列中GC含量能够反映出种属间亲缘关系的遗传特性[9,10]。

表2 rDNA-ITS的测序结果

结果显示，18株蜜环菌的rDNA-ITS碱基片段长度都在820-860 bp之间(其中含ITS引物，长度为223-224 bp)，C平均含量为20.8%，G平均含量为23.3%，A平均含量为23.2%，T平均含量为32.8%，GC平均含量为44.1%。除ZY-17与ZY-7外，其他菌株之间rDNA-ITS碱基片段长度或GC含量不同，这说明除ZY-17与ZY-7外的其他菌株之间遗传物质具有差异性。

利用Megalign软件对18株蜜环菌的rDNA-ITS序列进行两两比较，结果如图2。ZY-17与ZY-7差异度为1.9%，与其他菌株之间差异度在1.4%～8.0%之间，这说明ZY-17与其他菌株在种属关系上具有差异性。

图2 18株蜜环菌的rDNA-ITS序列相似性(上三角)和差异度(下三角)

2.1.3 酯酶同工酶酶谱分析 对供试的18株蜜环菌酯酶同工酶进行电泳，获到酯酶同工酶酶谱图，如图3。

图3 18株蜜环菌的酯酶同工酶扫描

如图3所示，供试18株蜜环菌酯酶都表现出较强的酯酶活性，18株蜜环菌共检测到112条酯酶同工酶谱带，每个菌株均有2-10条不等的酶带。供试的18个蜜环菌菌株得到了16个酶谱类型，其中ZY-17和ZY-7、ZY-16带型相似。

依据酶谱图中酶带的差异绘制酯酶同工酶模式图，如图4。结果显示，ZY-8和ZY-12无一级带，ZY-5、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18各有1条一级带，ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-10各有2条一级带，ZY-13和ZY-15各有3条一级酶带，ZY-9有4条一级酶带，ZY-11的一级酶带有5条，ZY-6的一级酶带有6条，ZY-8、ZY-12、ZY-17、ZY-18无二级酶带，ZY-4有6条二级酶带，其余菌株均有1-2条二级酶带。18个蜜环菌菌株的酯酶同工酶谱带均有不同，说明18个蜜环菌菌株之间的遗传物质表现型不同。

图4 18种蜜环菌的酯酶同工酶模式

2.2 品种比较试验

2.2.1 有性栽培 经过8个月的有性繁殖，以每箱白麻和米麻的总重量来统计天麻产量，如表3，在天麻有性繁殖阶段，与乌杆天麻种子伴栽的蜜环菌中天麻产量最高的是ZY-17，为每箱1.004 kg，ZY-9、ZY-5、ZY-16次之，分别为每箱0.893 kg、0.776 kg和0.623 kg，其他菌株的产量均不高；与红杆天麻种子伴栽的蜜环菌中，产量最高的菌株是ZY-9，天麻总产量为每箱1.277 kg，其次为ZY-17和ZY-5，分别为每箱1.238 kg和1.109 kg，其余菌株均未超过1 kg。

表3 不同蜜环菌对天麻有性栽培产量的影响 (kg)

2.2.2 无性栽培 经过8个月的无性繁殖，以每箱白麻和米麻的总重量来统计天麻产量，如表4，18株蜜环菌分别与乌杆天麻的种麻伴栽过程中，ZY-17对乌天麻产量的影响明显优于其他菌株，为每箱1.523 kg，其次为ZY-9、ZY-5、ZY-3、YZ-18、ZY-15、ZY-8、ZY-16，其余菌株均未超过每箱1 kg；ZY-17对红杆天麻产量的影响也明显优于其他菌株，每箱为2.931 kg，ZY-9的产量次之，每箱为2.232 kg，其他菌株的产量均未超过过每箱2 kg。

表4 不同蜜环菌对天麻无性栽培产量的影响 (kg)

2.3 区域试验

通过品种比较试验，优选出ZY-17、ZY-5、ZY-9三个蜜环菌菌株，以当地主栽品种京234为对照，连续两年6点次的区域试验产量统计结果见表5。从两年6点次的区域试验中可见，ZY-17伴栽天麻产量在各点次均居4个蜜环菌品种首位，均较对照品种京-234增产，增产幅度在29.70%～37.38%之间，比对照品种京-234平均增产33.17%。

表5 区域试验产量

2.4 生产试验

2.4.1 有性繁殖 天麻有性繁殖生产试验产量见表6，可见ZY-17伴栽天麻6点次的有性繁殖生产试验中，比对照品种“京-234”平均增产28.71%，其中4点次伴栽天麻品种为红杆天麻，ZY-17比“京-234” 平均增产28.81%，2点次伴栽天麻品种为乌杆天麻，ZY-17比“京-234” 平均增产28.53%。

表6 天麻有性繁殖生产试验产量统计

2.4.2 无性繁殖 天麻无性繁殖生产试验产量见表7，可见ZY-17伴栽天麻7点次的无性繁殖生产试验中，比对照品种“京-234”增产28.22%，其中4点次伴栽天麻品种为红杆天麻，ZY-17比“京-234” 平均增产27.22%，3点次伴栽天麻品种为乌杆天麻，ZY-17比“京-234” 平均增产29.55%。

表7 天麻无性繁殖生产试验产量统计

3 讨论与结论

通过系统选育筛选出具有目标性状的菌株ZY-17，定名“陕蜜2009”。该品种在秦巴山区多年多点的区域试验和生产试验中，表现出伴栽天麻产量高、菌种适应性强、稳定性好的特点，符合非主要农作物品种鉴定登记的条件，达到新品种审定要求。该品种于2017年4月25日通过了陕西省农作物品种审定委员会办公室非主要农作物品种鉴定登记。通过上述生产试验结果表明，陕密2009新品种可以进行推广伴栽天麻。