基于高效液相色谱技术的本科创新实验设计与实践

胡莺 孙姣霞 刘雪莲 潘瑾

摘 要：依托教师科研项目，以典型环境内分泌干扰物双酚A（Bisphenol A，BPA）为实验对象，基于高效液相色谱技术设计并开展创新实验，引导学生自主思考及实验探索，从分散液液微萃取前处理及高效液相色谱仪器分析两大方面，摸索并优化各项参数条件，建立高效、便捷的检测方法用于定量分析水样中BPA。创新实验设计结合了新颖的科研内容，激发学生主动探索的兴趣，不仅强化了学生的基本实验技能，而且培养和提升了学生的科研思维及综合运用知识的能力。

关键词：创新实验;实验教学;高效液相色谱

2016 年召开的全国科技创新大会提出，我国要在2030 年进入创新型国家前列，2050 年成为创新强国。实验室是高等学校实施素质教育、培养学生创新精神与实践能力的重要基地[1]，但常规的学生实验教学往往不能充分培养学生的创新能力。在当前国家大力推进大众创新创业的背景下，开设创新实验项目是高校培养学生协作能力、科研能力、创新能力以及综合素质的重要环节[2]。同时，教学和科研相辅相成，基于科研过程和科研成果的创新实验教学更有助于激发学生对知识的探索欲，加深学生对专业学科领域的认识，强化学生的创新意识，提升学生的创新思维[3]。促进科研与教学互动，把科研成果转化为实验教学内容，使实验教学从传统的“知识传授”转变为“知识、能力、思维、素质”综合素质培养，对推动大学生参与科学研究、营造良好的学术氛围、培养学生的创新精神具有深远意义，具有广阔的发展空间。

1 创新实验的设计背景及意义

合适的实验项目是创新实验开展的重要基础，创新实验设计结合新颖的科研内容，教学内容尚未涉及，具有一定的前瞻性，能引起学生主动探索未知的兴趣，并有利于培养学生的创新能力和综合素质，实现学生 “高分高能”的培养目标[4]。

BPA在工业上常被用来合成环氧树脂和聚碳酸醋等材料，从塑料袋、塑料饭盒、矿泉水瓶等日常用品，到医疗器械、食品包装的内衬等，生活中到处都有BPA的身影。BPA的大量生产和使用使它不断转移至环境，且大量研究已证明即便在极低剂量（ng/L）的存在下，BPA也能干扰人体及动物正常的内分泌系统，从而影响生殖功能，导致恶性肿瘤的产生等一系列严重损害，甚至具有遗传效应[5]。然而，在对环境样品中痕量的 BPA 进行分析的过程中，往往由于BPA的浓度较低甚至是微量、基质组成复杂而被干扰，常规检测方法达不到检测要求。因此，高效、灵敏、便捷的检测方法是开展BPA环境行为研究的基础和保障，同时，环境样品中BPA有效分离和富集的前处理至关重要。

分散液液微萃取（Dispersive  liquid-liquid  microextraction，DLLME）技术作为一种新型的样品前处理手段，自Rezaee 等人于 2006 年首次提出以来迅速成为研究热点[6]。Leong等在此基础上建立了上浮溶剂固化分散液液微萃取技术（DLLME-SFO），采取低密度有机萃取剂，并在萃取离心后结合冷冻固化使萃取相凝固以方便移取。DLLME-SFO进一步简化了操作，具有样品需求量小、有机溶剂用量少、操作简便、萃取时间短、环境友好等突出[7]。本创新实验结合分散液液微萃取上浮溶剂固化（DLLME-SFO）的样品前处理方法和高效液相色谱法（HPLC）定量分析技术的联用，指导学生全程参与实验的各个环节，设计并优化样品前处理及HPLC仪器分析的各项参数，建立快捷高效的水样BPA检测方法。教师全程指导，学生全程参与实验设计及开展，全方位培养学生的“知识、能力、思维、素质”。同时，注重培养学生掌握文献查阅和Word、Excel等文本编辑方法，以及SPSS、ORIGIN等数据统计分析软件的使用，学习科研论文的基本组成和撰写。

2 实验原理及核心内容

本创新实验的核心内容是从两个方面进行参数优化确定：其一是BPA定量分析的HPLC仪器检测条件;另一方面是样品的DLLME-SFO前处理条件。

基于环境介质的复杂性以及环境样品中BPA浓度通常较低的特点，通过样品前处理需要达到分离和富集的目的，将BPA从样品中分离出来并去除基体干扰，同时还要达到一定程度的富集效果以满足后续定量检测方法的检出浓度。在进行样品中BPA检测的DLLME-SFO前处理条件优化时，主要通过富集倍数（Extraction Factor，EF）和萃取回收率（Extraction Recovery，ER）两项指标进行萃取效果的考察和比較[8]，进而确定优化的萃取条件。

EF为上浮萃取相中BPA的浓度与水样中BPA浓度的比值，Cfloated为萃取所得上浮相中BPA的浓度，C0为水样中BPA的浓度。

萃取回收率ER（%）为萃取相中BPA的量占水样中BPA量的百分比例，Mfloated为上浮萃取相中BPA的质量，M0为水样中BPA的质量。Vfloated和V0分别为萃取相的体积和水样体积。

样品经过DLLME-SFO前处理，其中的BPA分离富集至萃取相，并经由离心冷冻后取出，所得到的萃取相融化后即可进一步结合检测仪器进行定量分析。与气相色谱（GC）和气相色谱/质谱（GC/MS）等相比，高效液相色谱（HPLC）具有操作方便、测定时间短等优势。在确定BPA检测的HPLC色谱条件时，需重点考察并确定流动相的种类及流量、检测波长、柱温、进样量等参数;并建立优化条件下BPA测定的标准曲线，用于BPA的定量分析。

最后，还需对实验所建立的DLLME-SFO-HPLC检测方法进行评价。采用逐步稀释法结合高效液相色谱工作站，确定方法的检出限和定量限。结合加标回收实验，分析加标回收率和相对标准偏差。从方法的线性范围、检出限、实际样品加标回收率等方面进行所建检测方法的综合评价。