侵染湖南甘薯种质资源的曲叶病毒和杆状病毒的检测及其亲缘关系分析

黄艳岚 张超凡 张道微 董芳 邹学校

摘  要：采用PCR技術对2015—2016年从湖南省多个市县采集的180份甘薯种质资源进行两种DNA病毒（sweet potato leaf curl virus，SPLCV和sweet potato badnavirus，SPBV）检测，并以PCR扩增产物序列为基础，对这两种病毒的亲缘关系进行分析。结果表明：（1）180份甘薯种质资源中，22份检测出SPLCV，占总数的12.2%;32份检测出SPBV，占总数的17.8%;8份同时检出SPLCV和SPBV这两种病毒，占总数的3.9%。（2）检出SPLCV的市县有长沙、永州、怀化、邵阳、郴州、常德、娄底、益阳、岳阳和株洲;检出SPBV的市县有长沙、永州、怀化、衡阳和邵阳;检出两病毒复合侵染的市县有怀化、长沙、永州和邵阳。（3）基于病毒全基因组序列分析显示，全球已报道的36个SPLCV分离物可分为3组，本研究获得的12个湖南分离物可分别归于3个组中，其中6个归于组Ⅰ，1个归于组Ⅱ，5个归于组Ⅲ，表明湖南SPLCV具有高度多样性。（4）基于病毒运动蛋白和外壳蛋白编码基因部分序列分析显示，全球已报道的36个SPBV分离物可分为4组，绝大部分分离物属于组Ⅰ，我国1个安徽分离物单独成组（组Ⅱ），我国2个山东分离物和1个海南分离物构成1个组（组Ⅲ），本研究获得的2个湖南分离物其中1个归于组Ⅰ，而另1个与已报道各分离物的核苷酸序列均存在显著差异，相似性仅为74.92%，单独成组（组Ⅳ），表明我国SPBV具有高度的变异性，存在多个变异类型。本研究结果可为湖南地区这两种病毒病防控提供依据。

关键词：甘薯种质资源;甘薯曲叶病毒;甘薯杆状病毒;鉴定与分析

中图分类号：S435.31      文献标识码：A

Detection and Genetic Relationship Analysis of Sweet Potato Leaf Curl Virus and Sweet Potato Badnavirus Infecting Sweet Potato Germplasm Resources in Hunan， China

HUANG Yanlan1， ZHANG Chaofan， ZHANG Daowei1， DONG Fang1， ZOU Xuexiao2*

1. Crop Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha， Hunan 410125， China; 2. Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China

Abstract： 180 sweet potato germplasm resources from different regions of Hunan were used to detect sweet potato leaf curl virus （SPLCV） and sweet potato badnavirus （SPBV） during 2015-2016. The genetic relationship of the two viruses was analyzed based on the sequence of PCR amplification products. 22 sweet potato germplasm resources were infected with SPLCV， making up 12.2% of the total， and 32 sweet potato germplasm resources were infected with SPBV， or 17.8% of the total. There were 8 sweet potato germplasm resources infected with both SPLCV and SPPV， accounting for 3.9% of all 180 sweet potato germplasm resources. SPLCV was detected in Changsha， Yongzhou， Huaihua， Shaoyang， Chenzhou， Changde， Loudi， Yiyang， Yueyang and Zhuzhou. SPBV was detected in Changsha， Yongzhou， Huaihua， Hengyang and Shaoyang. Both SPLCV and SPBV were detected in Huaihua， Changsha， Yongzhou and Shaoyang. Based on the whole genome sequence analysis of the virus， 36 SPLCV isolates reported in the world were divided into 3 groups. The 12 strains isolated from Hunan obtained in this study could be classified into 3 groups， six of them belonged to groupⅠ and one of them to groupⅡ， five of them to groupsⅢ， meaning that sweet potato leaf curl virus was highly diverse in Hunan. Based on the partial sequence analysis of viral movement protein and coat protein coding genes， 36 SPBV isolates reported in the world could be divided into 4 groups， the most of isolates belong to group I， and one Anhui isolate in China was divided into groupⅡalone. Two Shandong isolates and one Henan isolate in China constituted groupⅢ. One of the two Hunan isolates obtained in this study belongs to groupⅠ， and the other was significantly different from the reported isolates， only 74.92% similarity， classified groupⅣ. The results indicate that SPBV have high variability and many types of variation in China. This study could offer a useful reference for prevention and control of these two kinds of sweet potato virus diseases in China.

Keywords： sweet potato germplasm resources; sweet potato leaf curl virus; sweet potato badnavirus; identification and analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.031

甘薯（Ipomoea Batatas）在全球作物粮食生产中排名第七，是仅次于马铃薯和木薯的第三大块根作物[1]。据联合国粮食及农业组织（FAO，2017）统计数据，全球有120多个国家和地区种植甘薯，全世界甘薯种植面积约12.5×106 hm2，产量约18.5×107 t。甘薯为无性繁殖作物，病毒通过世代传递在甘薯块茎中累积，导致产量逐年降低，因此带病毒的甘薯种薯已成为世界各国产量存在差异的主要因素[1]。目前侵染甘薯的病毒达30多种[2]。国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）发布侵染甘薯的病毒有31种[3]。近年来，国内外甘薯生产上报道的主要病毒病害为甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt vitus，SPCSV）复合侵染导致的复合病害[4]，以及由甘薯曲叶病毒（sweet potato leaf curl virus，SPLCV）侵染产生的甘薯曲叶病害[5]。

SPLCV是双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）成员，基因组仅含有DNA-A，共编码6个开放阅读框：AV1（CP）、AV2、AC1、AC2、AC3 和AC4，由烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久性方式传播[6]。部分甘薯曲叶病毒侵染甘薯后叶片无明显症状，多数表现为叶缘向上卷曲、叶脉黄化、叶脉间褪绿斑驳[7]。甘薯曲叶病毒病害是对甘薯生产危害较大的病毒病害之一，可导致甘薯减产20%～60%[8]。SPPV也称为sweet potato badnavirus（SPBV），含SPBA-A和SPBB，属花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）杆状DNA病毒属（Badnavirus），包含5个开放阅读框：ORF1、ORF2、ORF3a、ORF3b和ORF4[9]，由粉蚧和少数种类的蚜虫以半持久性方式传播[10]。受SPPV侵染的甘薯植株无症状或表现为两种以上病毒共同侵染的症状[2，11]。

除甘薯种薯（种苗）易携带病毒外，甘薯种质资源也存在不同程度的病毒感染。Paprotka等[12]在巴西甘薯种质中鉴定出2个新的双生病毒新种、3个新的株系和其他变异株系，甘薯曲叶病毒阳性检测率为83.6%。Adane等[13]用ELISA方法检测埃塞俄比亚甘薯种质资源，存在甘薯羽状斑驳病毒、甘薯褪绿矮化病毒和甘薯病毒2的阳性率达64.7%、36.8%和1.8%，部分种质受甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒共同侵染。Barkley等[14]检测美国甘薯种质资源，有6.7%种质被检测为甘薯曲叶病毒阳性。董芳等[15]对采自邵阳市、长沙市、永州市和株洲市4个地区的甘薯种质检测甘薯曲叶病毒，阳性率为5.7%。以上研究表明2种或2种以上甘薯病毒的复合侵染已不断增加，导致协生而加重甘薯病毒病害[16]。

以2015—2016年从湖南省各市县采集的甘薯种质及湖南省农业科学院作物研究所甘薯种质资源圃的种质资源为材料，经前期检测，发现存在SPLCV[17]和SPPV[18]两种DNA病毒，本文通过检测甘薯曲叶病毒和甘薯杆状病毒的发生及分布情况，为甘薯病毒病防控提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

甘薯材料为101份地方品种和79份选育品种，共180份。地方品种是2015—2016年采自湖南省13個地级市34个县（区）的甘薯种质资源;选育品种是采自湖南省农业科学院作物研究所种质资源圃的甘薯资源。采样以1个甘薯块根萌发的植株为1个混合样本，叶片统一采摘甘薯植株新鲜展开顶叶3～4片，并记录症状。

1.2  方法

1.2.1  甘薯叶片基因组DNA提取  甘薯叶片基因组DNA提取参照CTAB法[19]（CTAB、Tris、EDTA、PVP、TEMED购自北京鼎国公司;其余试剂为国产分析纯）进行。

1.2.2  甘薯DNA病毒PCR引物筛选及反应体系的建立  SPLCV检测引物参照背靠背引物LCVQF1/R1、LCVQF2/R2、LCVQF3/R3和LCVQF4/R4[17]。SPBV检测引物参照SPBV保守区引物SPBV-F1、SPBV-F2、SPBV-F3和SPBV- R1、SPBV-R2、SPBV-R3[18]。

取甘薯叶片总DNA各3 ng为模板，利用SPLCV扩增的引物组合LCVQF1/R1、LCVQF2/ R2、LCVQF3/R3和LCVQF4/R4（表1）进行PCR扩增，10 ?L反应体系为：DNA模板约50 ng，2×Phanta Max Buffer 5 ?L，dNTP Mix（10 mmol/L）0.5 ?L，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.2 ?L，上下游引物（10 ?mol/L）各0.5 ?L，ddH2O补足10 ?L。反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。经PCR扩增，产物回收后与PMDTM19-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，测序委托武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行。利用SPBV正反引物两两配对组合（表1）进行PCR扩增，退火温度58 ℃，72 ℃延伸1 min，其余反应条件、测序鉴定与SPLCV鉴定的条件相同。

1.2.3  序列分析  序列用Blast进行比对，用MEGA7[20]软件对SPLCV和SPPV的核酸序列进行进化分析，用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，分支可信度Bootstrap为1000。

2  结果与分析

2.1  SPLCV的PCR检测

经引物筛选，甘薯叶片DNA样品用引物对LCVQF1/R1进行PCR检测，目的条带特异性高。阳性对照为Sim- 阴性对照为N3020。经检测，样品2、4、9、11和14能获得近3000 bp的特异性目的条带（图1）。通过对180份甘薯样品进行全基因序列检测，其中有22份检测为阳性。将目的条带回收测序，获得12个SPLCV基因全序列，大小在2769～2835 bp之间。

2.2  SPPV的PCR鉴定

经引物筛选，9对SPBV引物组合中，引物SPBVF3/R2扩增序列特异性强。用引物组合SPBVF3/R2对甘薯叶片DNA样品进行PCR检测，以Sim-1为阳性对照，以N3020为阴性对照。经检测，样品1～14能扩增出750 bp的目的条带（图2）。将目的条带回收测序，获得大小约700 bp的序列。通过对180份甘薯样品进行SPBV检测，其中有32份检测为阳性。

2.3  SPLCV核酸序列聚類分析

经Blast序列分析，本研究所得的12个SPLCV与NCBI下载的36个SPLCV序列进行核苷酸相似性分析，利用MEGA7的NJ法构建系统进化树（图3）。基于病毒全基因序列分析显示，全球已报道的36个SPLCV分离物可分为3组，本研究获得的12个湖南分离物与选取序列的核苷酸相似性为90%～99%，可分别归为3个组：SPLCV（21-5）、SPLCV（77）、SPLCV（4156）、SPLCV（6-1）、SPLCV（6-A5）和SPLCV（6-68）归于组Ⅰ，其中SPLCV（4156）与甘薯广西曲叶病毒（KJ476510）的相似性为95.51%，SPLCV（6-1）和SPLCV（6-A5）序列相似性为99.89%;SPLCV（3）归于组Ⅱ，与甘薯河南曲叶病毒4（KJ476509）、甘薯曲叶病毒日本分离物（AB433786）、甘薯曲叶病毒西班牙分离物（EF456744）、甘薯曲叶病毒日本分离物（AB433788）、甘薯曲叶病毒美国分离物（HQ333143）、甘薯曲叶病毒中国分离物（KX033430）聚为1组，其中SPLCV（3）与甘薯曲叶病毒日本分离物（AB433788）亲缘关系最近，相似性为95.77%;SPLCV（8-76）、SPLCV（8-47）、SPLCV（5）、SPLCV（194）、SPLCV（6126）归于组Ⅲ，与甘薯曲叶病毒中国分离物（DQ512731）、甘薯河南曲叶病毒（KC907406、KJ476507）聚为1组，其中SPLCV（8-76）与甘薯乔治亚曲叶病毒中国分离物（KX033423）亲缘关系最近，相似性为98.38%，这与聚类分析结果一致。

2.4  SPPV核酸序列聚类分析

对32份材料测序结果进行分析，序列可分为两大类，因此聚类分析只选择了SPPV-A1和SPPV-A22这2个代表性分离物。在NCBI核苷酸数据库中，SPPV基因组全序列较少，本研究获得SPPV-A1序列位于FJ560944核酸位点1563～2228 bp之间，SPPV-A22序列位于FJ560943核酸位点1514～2171 bp之间，均为ORF3a区域。基于病毒运动蛋白和外壳蛋白编码基因部分序列分析显示，全球已报道的36个SPBV分离物可分为4组（图4），绝大部分分离物属于组Ⅰ，我国1个安徽分离物（KT448757）单独成组（组Ⅱ），我国2个山东分离物（KT448748、KT448743）和1个河南分离物（KT448763）构成1个组（组Ⅲ），本研究获得的2个湖南分离物，其中SPBV-A1归于组Ⅰ，与甘薯杆状病毒TZ分离物（KF836892）亲缘关系最近，相似性为88.44%;而SPBV-A22与已报道各分离物的核苷酸序列均存在显著差异，与甘薯杆状病毒（FJ560943）相似性为74.92%，单独成组（组Ⅳ），表明我国SPBV具有高度的变异性，存在多个变异类型。

2.5  甘薯种质资源感染SPLCV和SPPV统计分析

180份甘薯种质资源共检测出SPLCV阳性样品22份，包括17份地方品种和5份选育品种，占总数的12.2%;检测出SPPV阳性样品32份，包括20份地方品种和12份选育品种，占总数的17.8%。其中8份甘薯种质资源样品均检测出SPLCV和SPBV这两种病毒，包含6份地方品种和2份选育品种，占总数的3.9%。SPLCV分布为：长沙5份，永州4份，怀化和邵阳3份，郴州2份，常德、娄底、益阳、岳阳和株洲各1份;SPBV分布为：长沙14份，永州8份，怀化5份，衡阳3份，邵阳1份;SPLCV和SPPV复合侵染的分布点为：怀化3份，长沙和永州2份，邵阳1份（表2）。

3  讨论

通过对湖南地区甘薯种质资源SPLCV和SPPV检测，从品种类型上分析，甘薯种质资源地方品种病毒单独侵染发生率和复合侵染发生率均高于选育品种。甘薯是无性繁殖作物，病毒通过昆虫媒介传播，在块茎中逐年积累，使甘薯产量降低，当地农户自留种的种植习惯使病毒积累成为目前地方品种产量降低的主要因素，种薯（种苗）的跨区域流通更加促进病毒的传播和累积。从分布区域上分析，甘薯种质资源SPLCV和SPPV检测率较高的分布点为长沙、永州、怀化和邵阳，郴州、常德、娄底、益阳、岳阳和株洲的病毒检测率较低，整体呈现出分布范围广、湘西南地区分布多，湘东北和湘西北分布较少的特点，病毒发病区域与董芳等[15]的研究结果相比有明显增加，这与昆虫媒介的传播、种薯的流通及甘薯块根内病毒的不断累积相关。此外，长沙地区作为城市核心地带，带病种薯通过核心区域的流通而促进病毒的传播。从病毒特征上分析，分离获得12个SPLCV湖南分离物基因全序列可分别归于3个组中，表明湖南SPLCV具有高度多样性。不同地区的SPLCV株系具有一定的相似性，相邻区域的SPLCV株系相似性较高，这与SPLCV在自然界传播过程中极易发生重组变异而产生新的株系有关[21]。相比SPLCV，本研究获得的2个SPBV湖南分离物中1个归于组Ⅰ，而另1个与已报道各分离物的核苷酸序列均存在显著差异，相似性仅为74.92%，单独成组（组Ⅳ），表明我国SPBV具有高度的变异性，存在多个变异类型。

自然界中植物病毒既能由单一的媒介进行病毒传播产生单独侵染，也能由不同媒介进行多种病毒共同传播而产生复合侵染[22]。复合侵染可分为不同种间和相同种内不同株系病毒的共同侵染，相比较单一侵染，病毒复合侵染能使寄主产生更严重的症状。不同种间病毒复合侵染在番茄、辣椒、菜豆上已有报道。刘微等[23-25]从带病毒病症状番茄植株中检测出番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒。王少立等[26]从山东辣椒检测出辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒。相同种间复合侵染如赵丽玲等[27]在云南凹头苋检测出番茄黄化曲叶病毒和胜红蓟黄脉病毒;Li等[28]在四川菜豆检测出烟草曲茎病毒、番茄黄化曲叶病毒和烟草曲茎病毒卫星DNA。甘薯不同种间复合侵染也有类似报道，黄利利等[8]检测广西甘薯病毒由两种或两种以上RNA和DNA病毒复合侵染，使甘薯表现出复杂的症状。姜珊珊等[29]检测出甘薯褪绿矮化病毒和甘薯曲叶病毒复合侵染山东甘薯，由此产生多重PCR方法检测用于甘薯病毒复合侵染的鉴定[30-31]。本研究从8份甘薯种质资源中检测的两种病毒为不同种间的病毒，且均为侵染甘薯的DNA病毒，叶片表现出严重上卷、叶脉肥大及叶片扇形皱缩等症状。Mbanzibwa等[32]从叶片卷曲、黄脉和生长发育迟缓的甘薯样本中检测出SPPV和SpSV/1这两种DNA病毒。表明病毒复合侵染甘薯产生的症状比单独侵染更重更复杂，而且DNA病毒单独侵染率和复合侵染率均呈增加趋势[33]。

目前针对单独侵染或复合侵染后具有相应病毒病症状的甘薯种质资源可以利用茎尖脱毒技术繁育健康种薯（种苗），对生产上流通的种薯或症状不明显而又需要检测的甘薯种质资源可以提取种薯（种苗）DNA，用SPLCV和SPPV病毒特异性引物进行PCR鉴定，达到快速检测目的，最大程度上降低该病毒的传播，对甘薯种质资源的保存与利用具有重要意义。

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责任编辑：沈德发