芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

谢小杰 余海霞 范志毅 黄方 刘源 莫啸 曾学梅 何新华 罗聪

摘  要：SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族，与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中，从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因，分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示，MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp，2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp，编码244个氨基酸，蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示，2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点，但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示，2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低，但在成花转变后期的芽中持续上调表达，在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。

关键词：芒果;SEPALLATA3;生物信息学;启动子;表达模式

中图分类号：S667.7      文献标识码：A

Bioinformatics and Expression Analysis of SEPALLATA3 in Mango

XIE Xiaojie， YU Haixia， FAN Zhiyi， HUANG Fang， LIU Yuan， MO Xiao， ZENG Xuemei， HE Xinhua， LUO Cong*

College of Agriculture， Guangxi University / State Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Agricultural Biological Resources， Nanning， Guangxi 530000， China

Abstract： SEPALLATA3 （SEP3） belongs to MADS-box gene family and is related to the flowering time and floral organ development of plants. In this study， two MiSEP3s genes which named MiSEP3-1 and MiSEP3-2 were obtained from mango transcriptome data. Bioinformatics analysis showed that the genomic length of MiSEP3-1 and MiSEP3-2 was 4189 bp and 3721 bp， respectively. Both genes had the same length of open reading frame and encoded 244 amino acids， with molecular weights 59.29 kD and 59.28 kD， respectively. Furthermore， MiSEP3-1 and MiSEP3-2 contained typical MADS and K-box domains. Promoter sequences analysis showed that MiSEP3s promoters both contained photoresponse elements， hormone response elements， stress response elements and transcription factor binding sites， but there were differences in the types and number of regulatory elements. Expression analysis showed that MiSEP3s were lower expressed in stem， leaf and bud at the vegetative stage， but significantly continuously up-regulated expression with the development of the flower and reached the expression peak in the flower. This study would provide references for the function study of MiSEP3.

Keywords： mango; SEPALLATA3; bioinformatics; promoter; expression pattern

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.007

開花是高等植物个体发育的中心环节，是植物从营养阶段向生殖阶段的过渡，20世纪90年代，继Coen等[1]提出植物花器官发育的ABC模型后，Theiben等[2]于2001年又提出了ABCDE模型，并认为ABCDE等5类功能基因共同作用控制植物花器官的形成。SEP类基因构成植物MADS-box基因家族的一个亚家族[3]，包括SEPALLATA （SEP3/AGL2）、SEP2 （AGL4）、SEP3 （AGL9）和SEP4 （AGL3） 4个基因，组成了扩展ABCDE花卉发育模式的E类，都主要在花组织中表达，它们冗余地参与4种花器官（萼片、花瓣、雄蕊和心皮）的发育和花分生组织的确定，是花器官发育所必需的基因，参与了花分生组织的整个过程[4]。已有研究表明，在花器官的发展中，SEP亚家族在调控植物生长发育的蛋白质相互作用中起着至关重要的作用[5]。拟南芥AtSEP3可能通过与开花促进因子SOC1和AGL24发生蛋白质-蛋白质或蛋白质-靶基因之间的相互作用而对成花转变过程进行负控制[6]。目前已从拟南芥（Arabidopsis thaliana）[7]、桃（Purnus pesrica）[8]、甜樱桃（Prunus avium）[9]、毛白杨（Populus tomentosa）[10]等植物中克隆了SEP3基因。

芒果（Mangifera indica L.）是一种原产印度的漆树科多年生木本植物，是重要的热带、亚热带果树，具有重要的经济价值，在我国主要分布在海南、广西、云南、四川、广东和福建等地，已成为我国热区农业的支柱产业[11-12]，但芒果的童期比较长，这严重阻碍了芒果新品种的选育[13]。目前已挖掘出一些芒果成花的相关基因，比如在拟南芥中过表达MiSOC1基因[14]、MiAP1基因[15]和MiFT基因[16]可以显著促进转基因植株的成花时间，但过表达MiCO基因会导致拟南芥出现晚花表型[17]。目前尚未见关于芒果MiSEP3基因的研究报道。因此本研究在前期研究的基础上，从芒果的转录组和基因组数据中挖掘获得了2个SEP3s基因的编码区序列、DNA序列和启动子序列，并对这些序列进行生物信息学分析，分析了2个SEP3s基因在芒果不同组织器官和成花发育不同阶段的表达模式，为进一步揭示SEP3基因在调控芒果开花方面的功能提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

芒果品种为‘四季蜜芒（Mangifera indica L. cv. ‘SiJiMi），栽培于广西大学农学院果树标本园。不同组织器官样本和不同发育时期样本分别于2018年11月5日、12月5日，2019年1月4日、1月29日、3月6日，分别采集成熟叶、成熟茎和芽/花（3月6日采集花，其余时期采集芽）。所有样品采集后立即保存于–80 ℃冰箱备用。

1.2  方法

1.2.1  芒果MiSEP3基因序列的获得与生物信息学分析  根据芒果转录组的基因注释信息，获得SEP3基因的编码区序列，进一步通过同源比对的方法，从‘四季蜜芒基因组数据中挖掘获得SEP3基因的DNA序列和启动子序列。利用BioXM 2.6软件推测SEP3基因的氨基酸序列;利用IBS 1.0软件生成SEP3基因的外显子-内含子结构。利用GenBank Blast在线软件（http：//www ncbi nlm nih gov/BLAST/）分析芒果SEP3同源基因与其他植物SEP3基因核苷酸序列同源性以及保守结构域;用MEGA 6.0软件采用邻接法（neighbour-joining， NJ）构建系统发育树。利用DNAMAN软件进行2个基因启动子序列的对比，利用植物顺式元件数据库PLANTCARE和NEW PLACE进行MiSEP3基因约2000 bp启动子区域顺式元件的分析。

1.2.2  芒果MiSEP3基因的表达分析  使用天根生化科技（北京）有限公司的RNA perp Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取‘四季蜜芒不同组织及不同发育时期花的样品总RNA，采用TaKaRa公司的M-MLV逆转录酶进行反转录合成cDNA第一链，引物采用T18，第一链合成的反应体系与程序参照试剂盒说明书进行。根据基因全长序列设计定量引物，以芒果MiActin1为内参[18]，引物设计采用在线设计软件Primer3 Input（http：// primer3.ut.ee/）（表1）。按SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa，中国大连）使用说明进行qRT-PCR分析。使用ABI 7500 Real Time PCR（Applied Biosystems，美国加利福尼亚）进行荧光定量PCR，反应操作步骤、反应体系和扩增程序参照仪器和试剂说明书进行，每个样品重复3次，采用2–CT法[19]进行相对表达量分析。使用SPSS 22.0软件对数据进行显著性检验，利用Excel 2007软件作图。

2  结果与分析

2.1  芒果MiSEP3基因的序列分析

从芒果转录组和基因组中筛选出2个MiSEP3s的cDNA和DNA序列，分别命名为MiSEP3-1（GenBank登录号：MW284816）和MiSEP3-2（GenBank登录号：MW284817）。MiSEP3-1和MiSEP3-2基因DNA序列长度分别为4189 bp和3721 bp，编码区长度均为732 bp。外显子-内含子结构分析显示，2个基因均包含8个外显子和7个内含子，并且每个对应的外显子长度一致，但内含子长度存在差异（图1）。MiSEP3-1和MiSEP3-2均编码了244个氨基酸，

所编码的氨基酸序列见图2。用ProtParam工具进行蛋白基本理化性质分析，结果显示，MiSEP3-1蛋白的分子质量为59.29 kD，等电点为4.96;MiSEP3-2蛋白的分子量为59.28 kD，等电点为4.96。

2.2  芒果 MiSEP3蛋白同源性及进化树分析

通过NCBI-Conserved Domain Search预测到2个MiSEPs蛋白的保守结构域，结果显示都含有MADS-box和K-box结构域，属于MADS-box基因家族，同源性比对分析显示，MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的核苷酸和氨基酸同源性分別为93.61%和93.03%，同源性较高。

从NCBI数据库下载不同物种的SEP和SEP- like的氨基酸序列，用MEGA 6.0软件构建芒果SEP3蛋白的系统进化树，结果显示整个进化树被分为4个独立的分支，芒果MiSEP3s与阿月浑子（Pistacia vera）PvSEP3和毛果杨（Populus tric-hocarpa）PtSEP3亲缘关系最近聚在一类，而与拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtSEP3最远（图3）。

2.3  芒果MiSEP3基因启动子序列分析

利用DNAMAN软件对2个MiSEP3基因启动子序列进行对比，结果显示，2个基因启动子的同源性仅为47.16%（图4）。利用在线软件NEW PLACE和Plant CARE对2个MiSEP3s基因约2000 bp的启动子序列进行顺式作用元件的功能及数量进行预测，结果如表2所示，2个MiSEP3s基因启动子的调控元件种类和数量存在差异，但2个基因均具有多种光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点等。比如SEP3-1有4个光调控相关元件，而SEP3-2有3个光调控相关元件，但多出1个与昼夜节律相关的元件。SEP3-1有8个激素调控元件，而SEP3-2有6个激素响应元件，但彼此之间元件的类型和出现的次数存在差异。SEP3-1和SEP3-2均含有2种不同的脱落酸（ABA）调控元件;SEP3-1含有2种生长素调控元件，而SEP3-2只有1种，且种类不同于SEP3-1;SEP3-1含有2种赤霉素调控元件，SEP3-2只含有1种赤霉素调控元件，且种类不同于SEP3-1。SEP3-1和SEP3-2均含有多个Dof、MYC、MYB、AGL15等转录因子结合位点。由此可以推测MiSEP3基因的表达可能受光、植物激素和逆境胁迫等因素的调控。

2.4  芒果MiSEP3基因在不同器官以及不同發育时期的表达分析

为了研究芒果MiSEP3基因在不同组织以及成花不同发育时期的表达模式，利用实时荧光定量技术，以‘四季蜜芒为材料，检测MiSEP3-1和MiSEP3-2的表达模式，结果见图5。MiSEP3-1和MiSEP3-2基因在‘四季蜜芒不同发育时期的不同组织中均有表达，但存在表达水平的差异，但2个MiSEP3s基因的表达模式类似。

在营养生长期，MiSEP3-1和MiSEP3-2基因在各个组织中均表达，但表达水平均较低，其中在芽中MiSEP3-2基因的表达水平显著高于MiSEP3-1基因。MiSEP3-1基因在成花诱导期和花芽分化期叶片中的表达水平高于营养生长期叶片的表达水平，而在顶芽中先略有降低，而后再次升高;MiSEP3-2基因在叶片中的表达模式与MiSEP3-1基因一致，但在顶芽中，MiSEP3-2基因的表达水平持续上升。从花芽分化后期开始，2个MiSEP3s基因在顶芽中的表达水平急剧上升，而在盛开的花中达到表达高峰，而此时2个基因在叶片中的表达水平也达到表达高峰。但在整过成花过程中，2个MiSEP3s基因在茎中的表达水平一直维持在较低水平。

3  讨论

SEP亚家族基因在植物花器官的分化和发育过程中发挥着非常重要的作用[20]，SEP类基因参与花器官发育和植物开花的调控[21]。在拟南芥中有4个E类基因：SEP1、SEP2、SEP3和SEP4，研究表明SEP1/2/3/4基因参与四轮花器官的发育，SEP3蛋白可以形成多聚体复合物决定花器官的形成和发育，且促使植物早开花[4， 20-21]。目前，已从许多植物中分离出了SEP类基因。在悬铃木（Platanus acerifolia）中，鉴定获得了2个SEP3s基因[22]。在番红花（Crocus sativus L.）中，克隆获得了4个SEP3基因[23]。在本研究中，从芒果转录组和基因组中挖掘获得2个SEP3s基因MiSEP3-1和MiSEP3-2，说明在不同物种中SEP3基因存在的拷贝数存在差异。

启动子对基因的表达起重要的调控作用，通过启动子可以改变基因的表达量进而影响植物的表型[24]。因此启动子的研究是基因工程和基因表达研究中的关键之一[25]。启动子除具有典型的核心启动元件外，还有众多与基因功能相关的调节元件。比如王静澄等[26]克隆分析毛白杨PtSEP3-1基因启动子发现，在PtSEP3-1基因启动子序列内含有大量光响应元件ACE、Box I和Box 4等，此外还有脱落酸响应元件ABRE，赤霉素响应元件GARE-motif以及胁迫响应元件HSE、TC-rich repeats等。本研究也得到了类似的结果，在MiSEP3基因启动子中发现了赤霉素响应元件WRKY71OS和MYBGAHV，脱落酸响应元件ABRE，以及大量的光响应元件。

在拟南芥中，SEP3有2个基因AtSEP3-2和AtSEP3- AtSEP3-2在根和茎中不表达，在叶片中表达量很低，在花器官中表达水平明显增加，AtSEP3-3在根和茎中几乎检测不到信号，而在叶片中开始积累，在雌蕊中的表达量最高[27]。莲NnSEP3基因在不同生长组织中表达不一，主要在花中表达[28];重瓣百合LiSEP3主要在花中表达，其中在最内侧花瓣中表达量最高[29];说明SEP-like基因可能在花形态建成和生殖生长中发挥重要作用。尽管SEP3表达模式存在差异，但其表达在许多物种中表现出高度的生殖器官特异性，比如在番茄[30]、烟草[31]、青岛百合[32]的花器官中高度表达。本研究中，MiSEP3-1和MiSEP3-2在‘四季蜜芒成花过程不同时期内的各组织中均有表达，二者均在营养期的茎、叶和芽中表达量较低，在花芽分化后期的芽/花中高度表达，这表明MiSEP3-1和MiSEP3-2基因在花芽分化之后才逐渐积累，说明SEP3基因在花的形成和发育过程中起着重要作用，但其功能尚需要进一步研究。

参考文献

[1]  Coen E S， Meyerowitz E M. The war of the whorls： Genetic interactions controlling flower development[J]. Nature， 1991， 353（6339）： 31-37.

[2]  Theiben G. Development of floral organ identity： Stories from the MADS house[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2001， 4（1）： 75-85.

[3]  Becker A， Theiben G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2003， 29（3）： 464-489.

[4]  Ditta G， Pinyopich A， Robles P， et al. The SEP4 gene of Arabidopsis thaliana functions in floral organ and meristem identity[J]. Current Biology， 2004， 14（21）： 1935-1940.

[5]  Kaufmann K， Muino J M， Jauregui R， et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3： Integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower[J/OL]. PLoS Biology， 2009， 7（4）： e1000090-10.1371/ journal.pbio.1000090.

[6]  Folter S D， Immink R G， Kieffer M， et al. Comprehensive interaction map of the Arabidopsis MADS Box transcription factors[J]. Plant Cell， 2005， 17（5）： 1424-1433.

[7]  Shi Q， Zhou J， Wang P， et al. Protein expression and characterization of SEP3 from Arabidopsis thaliana[J]. Genetics and Molecular Research， 2015， 14（4）： 12529-12536.

[8]  徐  勇， 谢  华， 常凤启， 等. 桃中SEPALLATA3同源基因的功能分析[C]//中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集， 2006： 46.

[9]  段续伟， 倪  杨， 张晓明， 等. 甜樱桃成花相关MADS-box基因的克隆及表达分析[J]. 果树学报， 2018， 35（1）： 20-31.

[10]      郭  伟. 毛白杨PtSEP3基因参与开花诱导和次生生长的调控作用研究[D]. 北京： 中国林业科学研究院， 2012.

[11]      鄭  斌， 文定青， 武红霞， 等. 芒果果实bHLH家族转录因子的生物信息学分析[J]. 热带作物学报， 2019， 40（2）： 289-299.

[12]     卢新喜， 罗 聪， 张秀娟， 等. 芒果MiCOL6基因的克隆及其生物信息学和表达分析[J]. 热带作物学报， 2020， 41（4）： 715-721.

[13]      魏丹凤， 曾黎辉. 木本果树开花相关基因的研究进展[J]. 亚热带农业研究， 2014， 10（2）： 134-140.

[14]      Wei J Y， Liu D B， Liu G Y， et al. Molecular cloning， characterization， and expression of MiSOC1： A homolog of the ?owering gene SUPPRESSOR OF OVEREXPRESS ION OF CONSTANS1 from mango （Mangifera indica L）[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 13.

[15]      Yu H X， Luo C， Fan Y， et al. Isolation and characterization of two APETALA1-like genes from mango （Mangifera indica L.）[J]. Scientia Horticulturae， 2020， 259（3）： 108814.

[16]      Fan Z Y， He X H， Fan Y， et al. Isolation and functional characterization of three MiFTs genes from mango[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2020， 155： 169-176.

[17]      Liu Y， Luo C， Zhang X J， et al. Overexpression of the mango MiCO gene delayed flowering time in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2020， 143（1）： 219-228.

[18]      Luo C， He X H， Chen H， et al. Molecular cloning and expression analysis of four actin genes （MiACT） from mango[J]. Biologia Plantarum， 2013， 57（2）： 238-244.

[19]      Schmittgen T D， Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocols， 2008， 3（6）： 1101-1108.

[20]      Leland J C， Cseke S B， Ravinder N， et al. SEP-class genes in Populus tremuloides and their likely role in reproductive survival of poplar trees[J]. Gene， 2005， 358（10）： 1-16.

[21]      Immink R G， Tonaco Isabella A N， Stefan D F， et al. SEPALLATA3： The ‘glue for MADS box transcription factor complex formation[J]. Genome Biology， 2009， 10（2）： R24.

[22]      Zhang S S， Lu S J， Yi S S， et al. Functional conservation and divergence of five SEPALLATA-like genes from a basal eudicot tree， Platanus acerifolia[J]. Planta， 2017， 245（2）： 439-457.

[23]      Athanasios T， Konstantinos P， Antonios M， et al. The study of the E-class SEPALLATA3-like MADS-box genes in wild-type and mutant flowers of cultivated saffron crocus （Crocus sativus L.） and its putative progenitors[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（14）： 1675-1684.

[24]      Luan Y X， Wang B S， Zhao Q， et al. Ectopic expression of foxtail millet zip-like gene， SiPf40， in transgenic rice plants causes a pleiotropic phenotype affecting tillering， vascular distribution and root development[J]. Science China， 2010， 53 （12）： 1450-1458.

[25]      查中萍， 李進波， 万丙良， 等. 水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析[J]. 湖北农业科学， 2010， 49（10）： 2341-2343.

[26]      王静澄， 李  昊， 崔东清， 等. 毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建[J]. 基因组学与应用生物学， 2010， 29（2）： 239-244.

[27]      马燕勤. 拟南芥和菘蓝SEP3基因不同剪接本以及菘蓝IiSEP1和IiSEP2基因功能研究[D]. 西安： 西北大学， 2019.

[28]      陈  岳， 张微微， 田代科， 等. 莲NnSEP3基因的克隆、亚细胞定位及表达分析[C]//中国园艺学会2015年学术年会论文摘要集， 2015： 2788-2788.

[29]      隋娟娟， 李晓昕， 杨秋燕， 等. 重瓣百合LiSEP3基因克隆与表达分析[J]. 南京林业大学学报（自然科学版）， 2017， 41（1）： 42-48.

[30]      Pnueli L， Hareven D， Broday L， et al. The TM5 MADS box gene mediates organ differentiation in the three inner whorls of tomato flowers[J]. Plant Cell， 1994， 6（2）： 175-186.

[31]      Jang S， Hong M Y， Chung Y Y， et al. Ectopic expression of tobacco MADS genes modulates flowering time and plant architecture[J]. Molecules and Cells， 2000， 9（6）： 576-586.

[32]      于佳玉， 朱梦瑶， 许  丽， 等. 青岛百合花发育E类基因LtSEP的克隆及表达分析[J]. 青岛农业大学学报（自然科学版）， 2019， 36（4）： 280-285， 291.

责任编辑：谢龙莲