高效液相色谱法同时测定柴石退热颗粒中八种成分含量*

张 亮，张志强，张 煜，刘 伟，伍 庆▲

(1贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2贵阳市第三实验中学创新实验室，贵州 贵阳 550001；3国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550018；4贵州烟叶复烤有限责任公司技术中心，贵州 贵阳 550005)

柴石退热颗粒由柴胡、石膏、黄芩等十味药材组成，具有清热解毒、解表清里之功效，是经反复筛选验证具有良好退热作用的中成药，其中的黄芩、金银花、大黄、蒲公英、连翘等都具有清热解毒等功效[1-8]。目前关于柴石退热颗粒的研究[9-13]主要集中在对乙型脑炎病毒等相关方面，对其化学成分的研究较少。目前研究仅对黄芩、金银花、大黄等做定性，对黄芩苷做定量测定。中药复方制剂通过多成分、多靶点协同作用发挥其功效[14]，因此研究多种化学成分具有一定意义。故本研究采用高效液相色谱法测定柴石退热颗粒中8种成分的含量，为其质量控制提供方法参考。

1 材料

1.1 仪器

Dionex UltiMate 3000液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)；AL-204 电子天平( 瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 药品与试剂

黄芩苷、绿原酸、大黄素、汉黄芩素、汉黄芩苷、连翘苷、黄芩素、咖啡酸(批号110715-200212、110753-200212、0756-200110、111514-200403、112062-201702、110821-201816、111595-200306、110885-200102)均购自中国药品生物制品检定所；三批柴石退热颗粒(批号：200101/200501/200601)均购自于市场；乙腈(HPLC)、甲酸(HPLC)、甲醇(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司；水(自制超纯水)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil® C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相：0.12%甲酸乙腈溶液(A)-0.12%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～5 min，2%A→6%A；5～15 min，6%A→11%A；15～25 min，11%A→22%A；25～30 min，22%A→24%A；30～32 min，24%A→28%A；32～40 min，28%A→28%A；40～45 min，28%A→37%A；45～55 min，37%A→45%A；55～65 min，45%A→58%A；65～70 min，58%A→65%A)；流速：1.0 mL/min；检测波长270 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液

精密称定对照品黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、咖啡酸、绿原酸和大黄素适量，甲醇制得浓度分别为72.00 μg/mL、3.24 μg/mL、3.40 μg/mL、2.80 μg/mL、13.68 μg/mL、0.84 μg/mL、4.50 μg/mL、6.00 μg/mL的混合标准溶液。

2.2.2 供试品溶液

精密称取柴石退热颗粒0.2 g于具塞锥形瓶中，加50%甲醇适量，称重，超声提取，补重，摇匀，滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察

分别取供试品和对照品溶液各适量，注入色谱仪(图1)。由图1可知，分离度大于1.5，且峰形良好，理论板数按黄芩苷峰计大于4000。

图1 混合对照品A和供试品B色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances(A)and sample(B)

2.3.2 线性关系考察

精密吸取不同浓度对照品溶液，注入色谱仪，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归(表1)。

表1 线性回归方程考察结果Tab.1 Investigation results of linear regression equation

2.3.3 精密度试验

分别吸取混合对照品溶液6份，注入色谱仪，计算黄芩苷、黄芩素等峰面积，其RSD分别为1.8%、1.6%、1.9%、2.1%、1.5%、2.2%、1.8%、2.6%，表明仪器具有良好的精密度。

2.3.4 稳定性试验

取同一批次(批号：200101)柴石退热颗粒，制备溶液，分别在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h测定，其RSD分别为2.4%、1.7%、1.9%、2.1%、1.3%、2.2%、1.8%、2.6%，均小于3.0%。

2.3.5 重复性试验

取同一批次(批号：200101)柴石退热颗粒，制备6份溶液，分别测定，其RSD分别为2.1%、2.3%、1.9%、2.1%、1.4%、1.6%、2.4%、1.7%，均小于3.0%。

2.3.6 加样回收率试验

精密称取已知含量的柴石退热颗粒(批号200101)0.1 g于锥形瓶中，分别加入适量对照品，制备溶液6份，测定含量(表2)。

表2 加样回收率试验测定结果Tab.2 Results of spiked recovery tests

2.4. 样品检测

取3批柴石退热颗粒样品，进行含量测定(表3)。

表3 样品含量测定结果(n=3，μg/mL)Tab.3 Content determination results of samples(n=3，μg/mL)

3 讨论

1)提取溶剂的选择

在对柴石退热颗粒中主要成分提取过程中，本试验研究采用甲醇、乙醇、无水乙醇、50%甲醇、70%乙醇等试剂对其中8种待测物进行提取，将提取得到的样品溶液在液相色谱上进行分析，根据所得色谱峰的多少以及主峰的大小决定选取哪种试剂，主峰越大以及色谱峰越多，说明这种溶剂的提取效果越好。当采用50%甲醇作为提取液时，所得到的色谱峰较多，8种待测物的峰面积较大，最终选择50%甲醇作为柴石退热颗粒的提取溶剂。

2)流动相的选择

本研究考察了甲醇、水、乙腈的流动相，而在进行等度洗脱试验时，色谱峰之间的分离达不到要求(R<1.5)，当采用甲醇(A)和水(B)梯度洗脱时，它的分离效果没有乙腈(A)和水(B)效果好，选择加入适当甲酸以改善峰形，所以最终选择0.12%甲酸乙腈(A)和0.12%甲酸水溶液(B)为流动相进行试验。

3)检测波长的选择

通过PDA检测器得到大黄素在255 nm和285 nm左右的吸收强度比较高，黄芩中4种待测黄酮类成分在278 nm左右的吸收强度比较高，连翘苷强吸收在280 nm，绿原酸强吸收在327 nm和246 nm，咖啡酸强吸收在323 nm，由于黄芩苷和绿原酸相对含量较高，在270 nm处待测物都符合分离要求，所以最终选择270 nm作为检测波长。

综上，本试验建立了柴石退热颗粒中8种非同一类型物质同时测定的方法，测定了3批柴石退热颗粒样品，说明建立的方法能够应用于柴石退热颗粒中多指标成分的测定，为其质量标准提升提供方法参考。