冠心病患者CYP2C19基因快代谢型与氯吡格雷抵抗作用研究

张艳双， 才 艺， 赵晓杰, 赵桂英， 刘文卿， 李 萍， 闫承慧

北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

氯吡格雷是一种广泛使用的抗血小板药物，能有效降低血小板活性，从而减少支架内血栓形成，对冠心病(coronary heart disease，CHD)的治疗及预防具有重要意义。氯吡格雷是噻吩吡啶类前药，需要被肠道吸收，通过肝中各种酶的代谢转化为活性成分，发挥其抗血小板凝集作用[1]。在肠内吸收后的氯吡格雷，85%被羧酸酯酶1水解为无活性的代谢物，并随尿液或粪便排出体外[2]，只有15% 氯吡格雷通过肝中的细胞色素P450激活产生活性代谢物，活性代谢物通过与血小板 P2Y12 受体的不可逆结合来抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集[3-4]。然而，由于各种遗传和非遗传因素导致氯吡格雷代谢发生改变，进而出现氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)，其机制尚不清楚。相关研究表明，CR可能受多种因素影响，如种族、年龄、遗传多态性、药物相互作用、患者依从性等[5-7]。有研究表明，氯吡格雷反应变异性与参与代谢的细胞色素 P450酶遗传多态性有关，CYP2C19负责将氯吡格雷转化为其活性代谢物[8-9]。根据代谢酶功能的基因型相关个体变异性常分为快代谢型、中等代谢型与慢代谢型[10]。CYP2C19快代谢型的正常患者中，服用氯吡格雷后血小板聚集率急剧下降，很少出现氯吡格雷抵抗。然而，较多CYP2C19快代谢型患者应用300 mg氯吡格雷负荷剂量后，血小板聚集率仍没有明显下降。本研究主要通过测定CYP2C19快代谢型CHD患者血小板聚集率、氯吡格雷血浆药物浓度等，旨在探讨CYP2C19快代谢患者出现氯吡格雷抵抗的原因，并进一步分析研究氯吡格雷的抵抗机制，为指导临床用药提供科学依据。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取北部战区总医院心血管内科自2020年7月至2021年7月收治的202例经CYP2C19基因型检测筛选为快代谢型CHD患者为研究对象。纳入标准：典型临床表现如胸痛、胸闷等，完善冠脉造影、心电图及心肌酶标志物等检查确诊为CHD；符合2012欧洲心脏病学会CHD指南[11]；临床资料完整，均进行CYP2C19基因型和血小板聚集检测。排除标准：对氯吡格雷药物过敏；肝肾功异常；活动性消化性溃疡；接受过大手术，脑血管意外或近期出血史。根据二磷酸腺苷诱导的血小板聚集率将其分为氯吡格雷抵抗组(CR组，血小板聚集率≥70%，n=92)与非氯吡格雷抵抗组(NCR组，血小板聚集率<70%，n=110)。本研究经医院伦理委员会批准。所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 药物使用方法 治疗方案为首次口服300 mg氯吡格雷负荷剂量后，规律口服75 mg/d[12]。

1.2.2 CYP2C19基因型检测 采集患者清晨空腹静脉血3 ml(EDTA Na2抗凝)。采用上海百傲科技有限公司提供的核酸提取及CYP2C19基因检测试剂盒，提取基因组DNA并经聚合酶链式反应进行扩增，扩增后杂交显色经BaiO基因芯片图像分析软件进行图像扫描和数据分析，筛选出快代谢型(野生型纯合子型CYP2C19 *1*1)。

1.2.3 血小板聚集率检测 采用美国HELENA AggRAM血小板聚集仪检测血小板聚集率。抽取患者空腹静脉两管蓝色帽枸橼酸抗凝血，每管3 ml，血与抗凝剂比例9∶1。一管血以748 r/min离心10 min，收集上清液浅黄色血清制备富含血小板的血浆(platelet-rich plasma，PRP)。另一管血以3 000 r/min离心10 min，收集上清液制备贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，做好标记。打开仪器，吸取250 μl PPP到检测杯准备空白，待黄色指示灯闪烁两秒变绿后移走检测杯。吸取225 μl PRP置于有小磁珠的检测杯中，并将其放置在测试通道中，使用加样枪向检测杯中加入20 μmol/L二磷酸腺苷25 μl，然后测量二磷酸腺苷诱导的血小板聚集率并记录。CR尚无统一定义，根据相关文献资料，血小板聚集率相对于基线水平降低<10%为CR[13-15]。

1.2.4 氯吡格雷血浆药物浓度测定 患者口服300 mg氯吡格雷负荷剂量后，次日采集患者清晨空腹静脉血3 ml蓝色帽枸橼酸抗凝血，以748 r/min离心10 min，收集血浆储存1.5 ml收集管中待检测。

1.2.5 溶液配制 称取适量氯吡格雷对照品，采用50%乙腈-水溶解并定容，得浓度约为1 mg/ml的储备液，于-20℃避光保存。吸取氯吡格雷储备液适量，采用50%乙腈-水稀释，得浓度为100、50、25、10、4、2、1 ng/ml的标准系列溶液。

1.2.6 色谱条件 色谱柱：ACQUITY BEH C18(100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：0.2%甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)组成，流速设置为0.25 ml/min；柱温：40℃；进样量5 μl。正离子模式下的多反应监测。参数如下：ESI正电离模式，锥孔电压为40.0 V，毛细管电压为3.2 kV，去溶剂化温度为450℃，离子源温度为100℃。去溶剂化、锥孔气体(氮气)的流速分别为600、50 L/h。

1.2.7 血浆样品预处理 取待测血浆样品200 μl置1.5 ml离心管中，分别加入10 μl内标溶液500 ng/ml和400 μl乙腈，涡旋振荡3 min，以12 000 r/min、4℃离心20 min。取500 μl上清液在35℃氮气流下吹干，用50 μl流动相复溶，取上清液进行高效液相液质联用分析。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 两组患者年龄、男性比例、体质量指数、高血压、糖尿病、他汀类药物、钙通道阻滞剂、雷贝拉唑肠溶片用药史比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。NCR组患者吸烟史比例高于CR组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料比较/例(百分率/%)

2.2 两组患者血小板计数与血小板聚集率比较 两组患者血小板计数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；CR组患者的血小板聚集率高于NCR组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者血小板计数与血小板聚集率比较

2.3 两组患者氯吡格雷血浆药物浓度比较 CR组患者氯吡格雷血浆药物浓度为(2.52±3.34)ng/ml，低于NCR组的(3.05±5.33)ng/ml，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

近年来，中国CHD发病率持续增加，病死率与致残率均较高[16]。氯吡格雷是目前临床治疗CHD患者最广泛应用的抗血小板药物之一。据报道，超过30% 接受该药物治疗的患者出现抗血小板疗效欠佳[17]。越来越多的研究表明，CYP2C19基因多态性导致对氯吡格雷的不同反应[18]，具有正常野生型等位基因的 CYP2C19基因编码一种功能性酶，可将氯吡格雷前药转化为其活性代谢物。与非携带者相比，携带至少1个无效等位基因的携带者氯吡格雷的活性代谢物减少了32.4%，血小板聚集率增加了9.0%[19]。有研究表明，CYP2C19的遗传变异与氯吡格雷活性代谢物的生物利用度、其抗血小板作用及临床结果的差异有关[20]。

本研究结果发现，两组患者血小板计数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；CR组患者的血小板聚集率高于NCR组，差异有统计学意义(P<0.05)。这表明，两组患者血小板计数正常无差异，血小板聚集功能出现差异。本研究结果还显示，CR组患者氯吡格雷血浆药物浓度为(2.52±3.34)ng/ml，低于NCR组的(3.05±5.33)ng/ml，但差异无统计学意义(P>0.05)。这一结果侧面反映出CYP2C19 快代谢型发挥了CYP酶活性，导致氯吡格雷血浆水平降低。两组患者氯吡格雷活性代谢物的减少，却并没有产生抗血小板作用可能与本研究的局限性有关。第一，本研究没有考虑多态性CYP3A的代谢活性，包括CYP3A4与CYP3A5，二者均为氯吡格雷活化的必需酶之一。有研究结果发现，CYP3A4与CYP3A5的活性与血小板聚集率无关，其基因分型和表型分析也不能预测氯吡格雷的抗血小板作用[21-22]。第二，接受氯吡格雷治疗的患者同时服用其他药物，如阿司匹林、钙通道阻滞剂、奥美拉唑、他汀类药物等，除氯吡格雷外，CYP3A4通路还代谢他汀类药物和钙通道阻滞剂，CYP2C19通路代谢质子泵抑制剂[23]。因此，药物相互作用也会影响氯吡格雷的代谢机制。第三，患者的依从性、糖尿病、高血压等基础疾病的影响，炎症因子水平与血小板功能异常引起的CR之间也密切相关。

综上所述，氯吡格雷在治疗CHD中起到至关重要的作用，CHD患者CYP2C19快代谢型发挥酶活性能有效抑制血小板聚集，但也会产生氯吡格雷抵抗，然而多种因素会影响对该药物的反应，如遗传多态性，药物相互作用、患者依从性、糖尿病等，为更好优化氯吡格雷抵抗防治策略仍需进一步探索研究。