miR-370-3p靶向STAT3调控喉癌细胞放射敏感性的分子机制研究

马俊 严仁纯 吴礼锋 王传喜 黄静江 李姚 左娜 吴成 张程林

miRNA为长度在18～24个核苷酸的保守短链非编码RNA，其在各种肿瘤中均具调节作用[1]，其中包括miR-370-3p。有研究报道，miR-370-3p在喉癌发挥抑癌基因的作用，但其调控机制尚未十分清楚。信号转导和转录激活因子3（STAT3）是许多致癌信号传导途径的会聚点，在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的免疫细胞中组成型激活[2，3]。活化的STAT3抑制针对肿瘤细胞的免疫激活所必需的介质的表达，STAT3活性促进免疫抑制因子的产生，所述免疫抑制因子在不同的免疫细胞亚群中激活STAT3，改变基因表达程序，从而抑制抗肿瘤免疫应答[4-6]。在肾母细胞瘤中STAT3可通过转录调控miR-370表达而下调WTX发挥抑制肾母细胞瘤生长的作用[7]。但miR-370-3p与STAT3在喉癌中的作用关系尚未清晰。本课题研究拟以喉癌细胞Hep-2为研究对象，检测喉癌组织和癌旁正常组织中miR-370-3p和STAT3的表达，观察过表达miR-370-3p、敲减STAT3和过表达STAT3对Hep-2细胞放射敏感性的影响，揭示其机制可能与miR-370-3p靶向STAT3有关，这将为增强喉癌放射治疗的效果提供依据。

材料与方法

1 材料

本研究的组织标本来源于皖南医学院第一附属医院弋矶山医院耳鼻咽喉头颈外科自2017年3月～2018年6月期间收治并手术治疗的喉癌患者，术中切除喉癌及癌旁组织标本共39件。本研究上报医院医学伦理委员会并批准，所有喉癌患者及家属均签署知情同意书。喉癌细胞Hep-2购于ATCC；LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒均购于大连Takara公司；MTT、DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清都购于美国GIBCO公司；RIPA蛋白裂解液、ECL发光液和SDS-PAGE试剂盒都购于碧云天生物技术公司；Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；PVDF膜购于德国公司。

2 方法

含10%胎牛血清的DMEM培养液用于培养Hep-2，置于37℃，5%CO2的培养箱中常规培养。

2.2 细胞处理与分组

待Hep-2细胞生长至80%～90%时，消化收集细胞后接种到6孔板中37oC、5%CO2培养24h。取各转染物（miR-370-3p mimics、miR-con、si-STAT3、si-con、pcDNA-STAT3、pcDNA、miR-370-3p+pcDNA、miR-370-3p+pcDNA）后用Opti-MEM对转染物进行稀释，使其终浓度为20nM，混匀，室温孵育5min。将6孔板中的培养液换为无血清培养基，分别向各组细胞中加入Lipo 2000和转染物（分组：miR-370-3p组、miR-con组、si-STAT3组、si-con组、pcDNASTAT3组、pcDNA组、IR+miR-370-3p+pcDNA组、IR+miR-370-3p+pcDNA STAT3组），37°C培养4-6 h；倒掉无血清培养液，PBS清洗2次，加入新鲜培养液，37°C培养48h，使用Siemens Primus直线加速器6MV高能X线室温照射，剂量率为3Gy/min，以0Gy、2Gy、4Gy、6Gy垂直照射10cm×10cm范围内的Hep-2细胞,在放射照射48h后，用qRT-PCR检测转染的效率。转染成功后，用于后续的试验。

2.3 qRT-PCR实验

取适量对数生长期的1.2.2各组细胞和研磨组织样品，按照RNA抽提试剂盒说明书中要求，提取RNA进行定量，按逆转录试剂盒说明书中操作合成cDNA。再按qRT-PCR试剂盒说明书中要求，进行miR-370-3p和STAT3检测。用2-△△Ct计算miR-370-3p和STAT3的表达水平，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.4 Western blot实验

取1.2.2各组细胞和研磨组织样品，加裂解液，冰上裂解30min。12000rpm离心10min。取上清液置于EP管中，加5×SDS上样缓冲液，沸水中煮沸10 min。电泳后，将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭膜2h，洗膜，加Ⅰ抗，4℃过夜，洗膜，加入Ⅱ抗，4℃2h。加入发光液，曝光。

随着国家铁路网建设与城市发展，穿越城区的部分铁路将通过外迁等方式重新发挥新的活力。与此同时原铁路走廊却逐步成为城市发展的一道“裂痕”。本文在对废弃铁路沿线问题剖析的基础上，结合铁路再利用模式提出了铁路沿线地区“面—线—点”的交通优化策略，并以南京宁芜铁路进行了实例分析，以期通过多种交通方式系统融合、沿线地区交通织补以及重要节点精细化设计与控制等策略方法，实现废弃铁路沿线地区交通系统的优化与提升。

2.5 Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验

将1.2.2各转染组细胞，用500uL结合缓冲液悬浮细胞，依次加入5uL的Annexin V-/FITC和PI，混匀，室温，避光静置15min。流式细胞仪分析测定的结果。细胞的凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品均重复3次。

2.6 双荧光素酶报告基因检测实验

取适量对数生长期的1.2.2各组细胞，按试剂盒技术手册中要求进行操作。psiCHECK2-STAT3-3′UTR WT和psiCHECK2-STAT3-3′UTR MUT的表达作为对照，psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性作为内参，转染24h，检测荧光强度。萤火虫荧光素酶的发光强度和海参荧光素酶的发光强度的比值，即反映miR-370-3p和STAT3的结合力。

2.7 统计学处理

所有实验数据均应用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用t检验，多组间数据的比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 在喉癌组织中miR-370-3p低表达和STAT3高表达

结果如表2所示，与Normal组相比，Tumor组miR-370-3p表达显著降低，STAT3 mRNA和蛋白表达均显著升高（图1）（P＜0.05）。

图1 检测喉鳞癌组织中STAT3的表达

表2 检测喉鳞癌组织中miR-370-3p和STAT3的表达（±s，例=3）

表2 检测喉鳞癌组织中miR-370-3p和STAT3的表达（±s，例=3）

*P＜0.05

Groups miR-370-3p STAT3 mRNA STAT3 Normal 1.00±0.08 1.01±0.07 0.45±0.05 Tumor 0.36±0.04* 2.47±0.18* 0.84±0.07*t 12.394 13.094 7.853 P 0.000 0.000 0.001

2 RT-PCR实验检测细胞株转染后miR-370-3p的表达情况

提取各组细胞总RNA，RT-PCR检测细胞中miR-370-3p的表达水平，结果显示，转染miR-370-3p后，细胞中miR-370-3p表达量明显高于对照组（包括Control组和miR-con组；P＜0.001）。相反的，转染anti-miR-370-3p后，细胞中miR-370-3p表达水平明显降低（P＜0.01）。由此证明，转染实验成功（图2）。

图2 细胞转染后，RT-PCR检测转染效率

3 过表达miR-370-3p可增加喉癌细胞的放疗敏感性

结果如表3所示，与miR-con组相比，miR-370-3p组喉癌细胞在4Gy、6Gy剂量下存活分数显著降低（P＜0.05）。单击多靶模型细胞存活曲线拟合结果为：miR-con组、miR-370-3p组D0(Gy)、Dq(Gy、N、SF2、k分 别 为2.681、2.162、2.240、0.763、0.373；1.233、1.054、2.350、0.404、0.811，如表4。

表3 检测喉癌细胞增殖（±s，例=3）

表3 检测喉癌细胞增殖（±s，例=3）

*P＜0.05

miR-con 1.00±0.09 0.724±0.088 miR-370-3p 1.02±0.07 0.413±0.048 t 0.304 5.374 P 0.776 0.006 0.423±0.076 0.092±0.018*7.341 0.002 0.185±0.017 0.021±0.003*16.455 0.000 Groups 细胞存活分数0Gy 2Gy 4Gy 6Gy

表4 单击多靶模型细胞存活曲线拟合结果

4 过表达miR-370-3p对放射照射后喉癌细胞凋亡的影响

结果如表5所示，与IR+miR-con组相比，IR+miR-370-3p组喉癌细胞凋亡率显著升高（图3）（P＜0.05）。

图3 检测喉癌细胞凋亡

表5 检测喉癌细胞凋亡率（±s，例=3）

表5 检测喉癌细胞凋亡率（±s，例=3）

*P＜0.05

Groups Apoptosis rate(%)IR+miR-con 8.98±0.92 IR+miR-370-3p 29.43±3.18*t 10.700 P 0.000

5 miR-370-3p靶向STAT3

应用miRcode数据库预测到miR-370-3p和STAT3 3′UTR存在的结合位点(图4A)；双荧光素酶活性检测的结果显示，同miR-NC组相比较，miR-370-3p组WT-STAT3细胞中荧光活性显著下降，而MUT-STAT3细胞中荧光活性则不受影响（表6）；同miR-NC组相比较，miR-370-3p组细胞中STAT3的表达水平显著下降；同anti-miR-NC组相比较，anti-miR-370-3p组细胞中STAT3的表达水平显著提高（图4B，表7）（P＜0.05）。

图4 miR-370-3p靶向STAT3的序列信息

表6 双荧光素酶报告实验（±s，例=3）

表6 双荧光素酶报告实验（±s，例=3）

*P＜0.05

Groups miR-con miR-370-3p tP WT-STAT3 1.00±0.09 0.42±0.05*9.757 0.001 MUT-STAT3 1.01±0.07 0.97±0.09 0.608 0.576

表7 STAT3调控miR-370-3p的表达（±s，例=3）

表7 STAT3调控miR-370-3p的表达（±s，例=3）

同miR-con组比，*P＜0.05；同anti-miR-con组比，#P＜0.05。

Groups miR-con miR-370-3p anti-miR-con STAT3 0.79±0.08 0.23±0.03*0.77±0.07 anti-miR-370-3p 1.39±0.11#F 110.930 P 0.000

6 RT-PCR实验检测细胞株转染后STAT3的表达情况

提取各组细胞总RNA，RT-PCR检测细胞中STAT3的表达水平，结果显示，转染pcDNA STAT3后，细胞中STAT3表达量明显高于对照组（包括Control组和pcDNA组；P＜0.001）。由此证明，转染实验成功，如图5。

图5 细胞转染后，RT-PCR检测转染效率

7 沉默STAT3对放射照射后喉癌细胞增殖和凋亡的影响

结果如表8所示，与IR+si-con组相比，IR+si-STAT3组喉癌细胞STAT3蛋白表达显著降低，在4Gy、6Gy剂量下存活分数显著降低（P＜0.05），如图6。

图6 检测沉默STAT3和放射后喉癌细胞中STAT3

表8 检测沉默STAT3和放射后喉癌细胞增殖和凋亡

8 过表达miR-370-3p和过表达STAT3对放射照射后对喉癌细胞放疗敏感性的影响

结果如表9所示，与IR+miR-con组相比，IR+miR-370-3p组STAT3蛋白表达显著降低（图5），在4Gy、6Gy剂量下细胞活性显著降低；与IR+miR-370-3p+pcDNA组相比，IR+miR-370-3p+pcDNA STAT3组STAT3蛋白表达显著升高（图7），在4Gy、6Gy剂量下细胞活性显著升高（P＜0.05）。

图7 检测喉癌细胞中STAT3蛋白的表达

表9 检测过表达miR-370-3p和 STAT3对放射后喉癌细胞增殖和凋亡

讨论

大量研究证实，miRNA参与多种疾病的发生发展，尤其是癌症，其在癌症中发挥癌基因或抑癌基因的作用[8，9]。miR-370-3p在膀胱癌、甲状腺癌、肺癌、食管癌、喉癌中均出现异常表达[10-12]。魏明辉等[13]、刘爱学等[14]在研究喉鳞癌中差异miRNA中均发现miR-370的表达水平出现异常降低。Wu等[15]在喉鳞状细胞癌的研究中证明了miR-370在喉鳞状细胞癌组织中下调，Forkhead Box ml（FoxM1）表达上调并与miR-370表达之间存在反向关系，随后通过荧光素酶报告基因测定证实FoxM1是miR-370的靶标，且在Hep2细胞中恢复的miR-370表达显著抑制细胞增殖，提示miR-370可能通过下调FoxM1在喉鳞状细胞癌中起肿瘤抑制作用。本研究通过检测喉癌组织中miR-370-3p和STAT3的表达水平，发现miR-370-3p的表达水平显著下降，而STAT3的表达水平显著提高，与以前的研究结果相一致。

越来越多的研究表明miRNA的异常表达有助于癌症对放射治疗的敏感性，放射治疗是喉癌的重要治疗方式，但部分早期喉癌患者对放疗有抗药性。Zhou等[16]运用GeneChip miRNA Array对放射治疗后原发性食管鳞状细胞癌和复发性食管鳞状细胞癌组织中miRNA表达进行分析发现，miRNA-381在辐射抗性组织和细胞中下调，miRNA-381的强制表达增加了食管鳞状细胞癌细胞的放射敏感性，并促进了非侵袭性表型，包括细胞增殖和迁移减少，且异种植瘤显示miRNA-381过表达降低了肿瘤生长和肿瘤异种移植物中对放射治疗的抗性，提示miRNA-381为食管鳞状细胞癌细胞放射敏感性的关键决定因素。Hu等[17]在喉癌的研究中发现，转染靶向shRNA的survivin后，MTS实验显示随着培养时间的延长，辐射组的存活率降低，此外，shRNA靶向存活蛋白消除了辐射诱导的G2期阻滞和放大的辐射诱导的细胞凋亡，另外在体内shRNA转染还增强肿瘤异种移植物对放射疗法的敏感性，可见喉鳞状细胞癌的放射抗性可能与存活蛋白表达增加有关，而存活蛋白抑制可能增强喉鳞状细胞癌的放射敏感性。存活蛋白与细胞凋亡相关，推测喉鳞状细胞癌的放射敏感性也许与喉鳞状细胞癌细胞凋亡相关。Xu等[18]研究发现，miR-24在喉癌中表达异常降低，过表达miR-24可抑制喉癌细胞生长，减少集落形成，并增强喉癌的凋亡，上调miR-24可通过增强细胞的凋亡增加喉癌对辐射的敏感性。本研究检测了过表达miR-370-3p的喉癌细胞Hep-2的放射照射的敏感性发现，过表达miR-370-3p可明显降低Hep-2细胞的存活分数，增强放射照射的敏感性；流式细胞术检测Hep-2细胞凋亡发现，过表达miR-370-3p可明显增强放射照射对Hep-2细胞凋亡的诱导能力；进一步用双荧光素酶报告基因检测实验验证，结果表明miR-370-3p靶向负调控STAT3。

STAT3在肿瘤细胞的生物学过程中发挥重要作用，其可导致诱导肿瘤的恶性行为。因此，STAT3已成为癌症精准治疗的希望靶标[19，20]。王海茹等[21]、郭慧等[22]在喉癌的研究中显示，干扰沉默STAT3可增强顺铂耐药和抗放疗喉癌细胞的耐药性和放射治疗的敏感性。本研究检测了沉默STAT3的Hep-2细胞发现，沉默STAT3可降低Hep-2细胞的存活分数，增强放射照射的敏感性和对Hep-2细胞凋亡的诱导能力；进一步研究表明，过表达STAT3可逆转miR-370-3p对Hep-2细胞放射照射敏感性的增强作用。

综上所述，miR-370-3p可增强放射照射对喉癌细胞的敏感性，其机制可能与靶向STAT3有关，为喉癌的治疗奠定基础。