2,4-滴原药中游离酚的含量测定——推荐一个农药相关杂质的紫外分光光度分析实验

韩丽君，徐彦军，郝向洪，刘丰茂，刘丹，潘灿平

中国农业大学理学院，北京 100193

在国内各大农林院校中，大部分学校设置有植物保护学科农药学专业的本科或专科课程，农药分析实验课是其中一门培养学生实验技能和灵活应用理论知识的重要专业基础课程。在这门课程的设计中，紫外分光光度分析每学期至少会涉及到1–2个实验内容，在农药分析中占有重要的地位。紫外分光光度法既可应用于农药化合物的定性鉴定，与红外、核磁和质谱一起构成“四大谱”用于农药有效成分或杂质的定性鉴定，同时也可应用于农药有效成分或杂质成分的定量分析，是农药原药和制剂质量标准中经常采用的分析方法之一。

然而，在高等院校涉及仪器分析的实验课程中，常常出现实验设计和实验内容较为简单、与实际应用无法结合的问题，难以达到应有的教学效果。如何将一个实验课设计得既让学生深化理论知识、又让学生体会到实验内容的应用特色和实际应用价值，是我们需要思考和探索的问题。对于针对农药学专业的学生开设紫外分光光度分析实验，实验内容的选择既取决于高校自身的教学实验条件，又与实验教师的教学理念密切相关。在农林院校开设的紫外分光光度法的实验课程中，不少高校只开设了一些基础型实验，实验设计相对简单，一般实验内容只是采用紫外光谱仪对1–2种常见的农药化合物进行紫外光谱扫描，观测其紫外光谱图的形状和最大吸收波长的位置；在定量分析方面，则较多的是让学生学习制作标准曲线，对未知样品进行定量分析。显然，这些实验内容与仪器分析或光谱分析实验课上的基础实验内容高度重复，仅仅是把待测化合物换成了农药化合物而已，没有让学生体会到农药学方面的专业特色和实际应用价值。因此，在设计农药学专业方面的学生实验时，很有必要在综合实验技能的基础上让学生同时学习到专业特色的实验技能和专业知识，让学生在掌握基础知识相关技能的同时，提升实践应用能力。

笔者在多年的农药分析实验教学中以提高学生应用能力为核心理念，不断探索和创新，设计了一个新的紫外分光光度法应用于农药分析的实验：2,4-滴原药中2,4-二氯苯酚的含量测定。通过这个实验，将农药原药质量分析的基本思想、相关杂质的概念及分析思路、结合紫外分光光度分析，让学生了解农药分析的专业特色与应用前景，取得了良好的教学效果，可供应用化学、农药学及相关专业本科及专科生实验教学采用。推荐如下。

1 实验目的

(1) 学习农药原药中相关杂质分析的概念和要求；

(2) 熟悉采用紫外分光光度法进行杂质分析的过程和数据处理方法；

(3) 学习复杂样品分析中衍生化方法在紫外分光光度法中的应用。

2 实验原理及背景知识

农药的质量分析与安全性评价，除了有效成分定性鉴定和含量分析之外，原药和制剂产品中的杂质也是重要的因素。农药产品中相关有害杂质的判定和分析，不仅直接关乎农药产品的使用效果，而且对人体健康、环境安全和农产品安全产生重要的影响，因此农药相关杂质管理已成为各国农药登记管理的重要内容，相应的农药相关杂质分析也成为农药标准中不可或缺的部分。

2.1 农药相关杂质的概念、判定及方法要求

农药原药中的杂质主要是合成过程中产生的副产物、残留的原材料、储存过程中的分解产物和原材料带入的杂质。农药制剂中的杂质则主要来源于加工使用的原药和助剂或者加工或贮存过程中产生的杂质。当杂质与其相关的有效成分相比，对人类和环境具有明显毒害、对施用作物产生药害、引起农产品污染、影响农药产品质量稳定性或引起其他不良影响时，该杂质被称为“相关杂质”。

农药产品中的杂质相关性的判定是对实际情况进行科学评价做出的结果。联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)共同组织的农药标准联席会议(JMPS)通常默认采用全球化学品统一分类和标签制度(GHS)对于混合物的分类标准。例如，对于皮肤和眼睛刺激物设定标准为10 g·kg−1，对于具致敏性、致突变性、致癌和生殖毒性的化合物设定标准为1 g·kg−1。作为默认的方法，当原药产品中的杂质含量>最大可接受浓度的10%时，即为相关杂质。因此对于皮肤和眼睛刺激物，当含量达到1 g·kg−1时即为相关杂质，对于具致敏性、致突变性、致癌和生殖毒性的化合物则大于0.1 g·kg−1即为相关杂质[1]。农药产品中的相关杂质分析在农药质量控制和分析中非常重要。由于相关杂质的含量一般都较低，因此要求其分析方法不仅具有良好的准确度和精密度，而且要求有较高的检测灵敏度。

2.2 2,4-滴及其相关杂质概述

2,4-滴，通用名称为2,4-二氯苯氧乙酸，有多种盐类和酯的加工剂型，如2,4-滴钠盐、2,4-滴丁酯等。2,4-滴在低浓度(30 mg·L−1以下)时用作植物生长调节剂，在高浓度(500 mg·L−1以上)时则作为除草剂，用于麦、稻、玉米、甘蔗等作物田中防除藜、苋等阔叶杂草及萌芽期禾本科杂草。2,4-滴的常用工业合成路线是先用苯酚氯化制得2,4-二氯苯酚，然后以2,4-二氯苯酚在氢氧化钠存在下与氯乙酸缩合生成2,4-滴钠盐，再用盐酸酸化成2,4-滴原药[2]。因此在2,4-滴的合成过程中，少量的2,4-二氯苯酚会残存在2,4-滴产品中，以农药杂质的形式随农药施用到作物和环境中。2,4-二氯苯酚的毒性研究表明其对人的皮肤、眼睛及呼吸系统有刺激性，老鼠急性口服LD50为0.58 g·kg−1，对水生生物有毒[3]，已被JMPS认定为2,4-滴产品中的必须检测的相关杂质。我国现行化工行业标准(HG/T 3624–2016)规定[4]，2,4-滴原药中游离酚(以2,4-二氯苯酚计)的含量不得高于0.2%。

2.3 2,4-滴原药中2,4-二氯苯酚的检测方法

从化学结构来看，2,4-二氯苯酚可采用色谱方法进行检测分析[5,6]，此外，2,4-滴和苯酚类化合物由于都含有苯环结构，在紫外光谱区都有吸收峰。资料表明，苯氧基化合物从化学结构上(见图1右)可看作是苯酚上的H被烷基取代，其紫外光谱吸收峰与苯酚相似，从图1(左)可以看出，2,4-滴和2,4-二氯苯酚在中性条件下的最大吸收波长十分接近，均为284 nm；但不同之处在于，在碱性介质中，2,4-二氯苯酚的最大吸收波长显著红移到了308 nm，而苯醚类衍生物2,4-滴的最大吸收波长不变，仍为284 nm。理论上来说，我们可以据此检测2,4-滴原药中存在的少量2,4-二氯苯酚杂质。然而实验表明，由于2,4-二氯苯酚杂质的含量很低，直接采用紫外分光光度法检测2,4-滴原药中的游离酚含量时，无法达到所要求的检测灵敏度，且如果体系中有其他化合物在308 nm也有紫外吸收，会对检测结果造成干扰。

图1 2,4-滴及2,4-二氯苯酚的化学结构(右)及其在中性及碱性介质中的紫外吸收光谱图(左)

因此，本实验采用了简便灵敏的苯酚类化合物的4-氨基安替比林光度分析法[7,8]，该方法适合于微量酚的测定，其基本原理是[9,10]，酚类化合物(2,4-二氯苯酚)在pH 10.0 ± 0.2介质中，在铁氰化钾的存在下与4-氨基安替比林反应，生成橙红色的吲哚酚安替比林染料，其水溶液在520–525 nm波长处有最大吸收，反应方程式见图2。本实验中，由于农药样品水溶性较低，需要采用少量的有机溶剂(乙醇或丙酮)溶解后进行显色反应及光度分析，测定吸光度后由校正曲线查出相同吸光度下标样的体积，即可计算2,4-二氯苯酚的含量。

图2 2,4-二氯苯酚与4-氨基安替比林的反应方程式

3 仪器与试剂

3.1 仪器设备

紫外可见分光光度计(日本岛津UV-2600型)，漩涡混合器(山东欧莱博科技有限公司)；25 mL具塞量筒(或者容量瓶) 8个，移液管(0.1、0.2、0.5、1.0 mL各一支，5 mL、10 mL 各3支)，滴管等。

3.2 试剂与溶液

2,4-二氯苯酚标准品：标样纯度≥98.0%。乙醇，丙酮，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

氨溶液A：c(NH3) = 0.05 mol·L−1

氨溶液B：吸取90 mL氨溶液A，加入50 mL乙醇，用水稀释至1 L。

2,4-二氯苯酚标准溶液：将100 mg 2,4-二氯苯酚标准品(精确至0.1 mg)溶于10 mL丙酮中，用水稀释至1 L。

4-氨基安替比林水溶液：2 g·L−1，使用时用20 g·L−1贮备液配制(贮备液在暗处可存放3个月)。

铁氰化钾水溶液：4 g·L−1(用时现配)。

4 测定步骤

4.1 标准曲线的绘制

用移液管依次吸取上述2,4-二氯苯酚标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，分别放入6个25 mL具塞量筒中，用氨溶液B将其补加到10 mL，再依次加入5 mL氨溶液A、5 mL 4-氨基安替比林溶液和5 mL铁氰化钾溶液，加完后摇匀，静置5 min，得到系列标准溶液。

另取一个25 mL具塞量筒，加入10 mL氨溶液B，然后按上述步骤依次加入5 mL氨溶液A、5 mL 4-氨基安替比林溶液和5 mL铁氰化钾溶液，摇匀后静置5 min，得到空白溶液。将上述标准溶液以空白溶液作为参比，依次测定其在520 nm下的吸光度。

4.2 待测样品(2,4-滴原药)中游离酚的含量测定

准确称取试样1.0 g (精确至0.0001 g)，置于1000 mL容量瓶中，加入50 mL乙醇使之溶解，然后加入90 mL氨溶液A，用水稀释至刻度。移取10 mL该溶液放入25 mL具塞量筒中，依次加入5 mL氨溶液A，5 mL 4-氨基安替比林溶液和5 mL铁氰化钾溶液,加完后摇匀，静置5 min，得到待测样品溶液。然后以空白溶液作为参比，测定该溶液在520 nm下的吸光度。样品应进行两次平行测定。

注意，为了减小误差，实验过程中可根据仪器的灵敏度，增加或减少标样及样品的称样量，尽量使吸光度值在0.2–0.8之间。

5 数据处理

将测得的标准溶液吸光度值对相应的标准酚溶液的体积作图，即得校正曲线。由校正曲线查出待测溶液吸光度对应于标准酚溶液的体积V(mL) ，以质量百分数表示的游离酚的百分含量(X)按式(1)进行计算：

式(1)中：m标为标样的质量(g)，m样为试样的质量(g)，V标为标样的定容体积(mL)，V样为试样的定容体积(mL)；ω为标样的纯度；系数10为试样溶液的移取体积10 mL。

两次平行测定结果之相对相差应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果。按照我国现行化工行业标准HG/T 3624–2016的规定，2,4-滴原药中游离酚(以2,4-二氯苯酚计)的含量不得高于0.2%，可以此作为样品合格与否的判定标准。

6 实验要求

学生需要提前预习实验内容，实验过程中要求学生记录实验现象及实验数据，实验完毕后要求学生分析实验数据，对实验原理及相应的实验过程进行讨论，写出实验心得，整理完成实验报告。

7 实验中存在的危险及预防措施

本实验中使用的丙酮、乙醇为易燃试剂，农药原药及杂质标准品属于有毒试剂，因此学生在试样配制过程中需要全程穿实验服、佩戴护目镜和防护手套，在远离热源和火源的通风橱中操作。

8 实验过程讨论及代表性实验数据

本实验基本参照了我国化工行业标准HG/T 3624–2016的实验方法，第一步即为系列标准溶液、空白溶液及样品溶液的配制，所配制的溶液会呈现不同的颜色，学生需要观察和记录实验过程的颜色变化，图3为学生配制的溶液照片。

图3 实验过程中配制的显色溶液及标准溶液

本实验室所配备的紫外-可见分光光度计为岛津UV-2600型，为了减小误差，实验过程中根据仪器的灵敏度，将标样及样品的称样量分别提高到了200 mg和2.0 g，尽量使吸光度值介于0.2–0.8之间。本实验采用配套的UV Probe数据采集软件进行分光光度分析，所测得的代表性数据列于表1，绘制的校正曲线见图4。由数据可知，吸光度值对应标准酚溶液的体积所得到的校正曲线线性回归方程为y= 1.1152x− 0.0144，线性决定系数R² = 0.9997，说明本方法在标准酚溶液体积为0.1–1.0 mL范围内线性关系良好。按照式(1)计算，得到对应的2,4-滴原药中游离酚的百分含量范围为0.1%–1.0%。由于实验室购得的2,4-滴原药样品来源和批次不同，每批学生得到的实验结果可能会不同，要求学生在平行测定的相对误差小于20%的前提下根据实验结果给出合理判定即可。

图4 吸光度值对应标准酚溶液的体积所得到的校正曲线

表1 标准曲线数据表

9 学生心得及评价

在三年的教学实践中，学生普遍认为该实验在熟悉紫外分光光度法基本操作的基础上拓展了很多内容，使他们在以下几个方面有很大收获：(1) 该实验深化了在课堂教学中学到的农药标准及相关杂质的内容，使课堂内容得到了具体应用；(2) 学生首次接触到了“常量分析中的微量分析”所要考虑的要素，即在主成分含量很高的情况下分析杂质成分时应该如何对分析方法进行合理设计；(3) 首次学到了在衍生化显色过程中平行操作的基本思想和数据处理方法；(4) 首次学习了如何运用农药标准对产品指标进行判定，深刻意识到了所学知识的具体应用价值。

10 对指导教师教学实践的讨论和建议

本实验的设计思想是：将农药的质量标准、农药相关杂质的概念和要求、农药相关杂质的定量分析实验设计、实验过程、数据分析、撰写报告等过程综合起来，让学生对本实验的目的、应用价值、实验的设计思路及整个实验过程有全面总体的认识，培养学生对一个实验的来龙去脉进行全方位的思考，提高其独立思考问题和解决问题的能力。在教学实践中要使这些教学思想得以深化，使学生在实验课上“不仅动手操作，还要动脑思考”，达到既定的教学目标，指导教师应该起到一个“引导和指导”相结合的作用，具体有以下一些建议：

(1) 当我们遇到一个待测化合物需要测定的时候，首先通过提出问题的方式引导学生开动脑筋，思考和讨论这个化合物一般可以采用哪些方法进行测定？例如在本实验中可以首先提出问题，即从2,4-二氯苯酚的化学结构来思考，是否可以采用色谱法进行测定？答案是肯定的，因为它具有一定的挥发性且在高温下稳定，可以考虑采用气相色谱法分析；同时它带有芳香基团，具有紫外吸收，因此也可以考虑采用带有紫外检测器的液相色谱进行检测。然后引导学生分析本实验较为复杂的具体情况，即待测样品中母体化合物2,4-滴的含量很高(一般在95%以上)，而游离酚在样品中的含量很低(限量要求不超过0.2%)，因而上述两种色谱法均存在检测灵敏度达不到标准要求和容易受到高浓度主成分或其他化合物干扰的问题。在这些思考的基础上，指导教师再对本实验所采用的4-氨基安替比林显色法进行具体讲解，使学生不仅学习了具体的实验内容，而且对实验的基本设计思路和应用价值有了深刻的认识。

(2) 一个好的实验设计不一定要照本宣科、完全遵照传统，而是应该开动脑筋，使方法简便易行。例如，传统的紫外分光光度分析实验中，标准曲线的制作都是以吸光度值对标准溶液的浓度制作标准工作曲线，而本实验中，巧妙地运用了标准溶液与待测溶液的平行操作，直接以吸光度值对配制工作溶液时加入的标准溶液的体积作图，然后以对应的体积计算质量百分数。这种简化使该方法在实际应用中简便易行，减少了由计算过程导致的错误发生，非常适用于工厂的大批量产品质量检测。这种数据处理方式新颖独特，但也是学生们容易产生疑问的地方，指导教师需要帮助学生在理解平行操作的基础上进行推导和掌握。

(3) 教学实践表明，指导教师对实验过程的点评和对实验效果的积极评价也会提高学生的学习能动性。建议本实验的教学评价方法为：学生积极回答问题和参与讨论，占10%；样品前处理，占20%，这一点主要通过观察学生天平的使用及配制的溶液体积是否与25 mL刻度线吻合来评价；仪器使用及样品测定操作是否规范，占20%；数据分析，占30%，这一点主要通过标准曲线回归系数是否大于0.99及测定结果的相对误差是否合理来评判；实验报告撰写是否认真及结果讨论是否合理，占20%。指导教师可根据学生在以上各方面的具体表现，有的放矢，通过讲解、讨论和具体指导等方式，进一步提高实验课的教学质量和教学效果。

11 结语

本文推荐的教学实验适合于本专科农林院校的化学、应用化学、植物保护及农药学等专业方向为大学三年级学生学习使用，要求学生具有一定的分析化学、光度分析、农药学或农药分析方面的基础知识。建议学生2人一组，推荐教学时数为6学时(每学时50分钟)，其中1学时用于实验原理及内容讲解，3学时用于溶液配制和紫外测定，1学时用于数据处理和实验讨论，最后1学时用于教师点评和答疑。本实验有助于启发学生在从事农药分析及其他相关专业工作时，把学到的实验设计思路、实验方法加以应用。实验所涉及到的背景知识较为全面，实验方法简便可靠，所设计的实验内容可供化学、植保、农药学、食品、环境等相关专业学生实验教学选用。