紫外-可见分光光度法测定含铜废水中的铜离子

章子恒，胡然，马艺瑾，孙兴蓉，马思维，朱忍，曹秋娥，周川华

云南大学化学科学与工程学院，化学化工国家级实验教学示范中心(云南大学)，昆明 650091

在本科基础化学教学实验中，分析化学实验占有重要地位。其内容常包含分析化学基础实验与兼具应用性和综合性的创新实验[1]。目前，传统分析化学实验教学模式存在诸如学生学习被动、兴趣不强、缺乏创新意识等问题[2]。为紧跟学校教学改革的步伐，进行创新实验教学的初步探索，本文设计了一个仪器分析创新教学实验。该实验结合原有教学实验快速、准确的优点，并将新方法引入仪器分析实验教学中。这使其在呈现创新性的同时，也在一定程度上将相对新颖的科研成果与本科教学联系起来，令学生在学习及操作的过程中感受到科研的魅力，从而激发学生的学习热情与兴趣，进而充分提高学生的动手能力，培养具有科学思维方法和创新能力的人才[3]。

本实验基于芬顿反应(Fenton reaction)，显色底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB，3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)，采用紫外-可见分光光度法测定废水中铜离子的含量。

芬顿反应为无机人名反应之一，现今多用于污水处理、酶促反应、有机合成等诸多方面[4]。铁、铜、铝、铬等变价金属离子可作为芬顿反应的催化剂。其中，属铁基芬顿反应最为常见、应用最广；而铜基芬顿反应的反应速率更快，所适用的体系pH范围相对更宽[5]。基于该反应，可建立用于检测芬顿反应体系中各物质的分析方法，如：比色法[6]；荧光光度法[7]；化学发光法[8]；分光光度法[9]等。

TMB常被用作酶促反应的显色底物[10]，在临床生化检验等方面应用广泛。该物质安全绿色，适合本科实验使用。

金属铜是冶金工业、电镀工业的重要原料，该类行业常排放大量含铜废水[11]。废水中铜离子检测方法多样，如各类光谱法、色谱法等[12]；电化学传感器[13]、荧光探针[14]等较为先进的手段亦可用于检测铜离子。本实验采用紫外-可见分光光度法检测铜离子，该方法是仪器分析教学的重要内容之一，且相对简单、易理解，适于本科教学。

根据芬顿反应氧化TMB，产生紫外-可见吸收的原理，本团队设计优化此实验，使之简单快捷，便于操作。该实验灵敏度较高、重现性好，满足本科教学实验基本要求。

本实验将催化反应引入本科教学实验，且无需使用价格昂贵、容易变性失活的生物酶，适用于本科教学。芬顿反应在实验设计上灵活多变，可以设计为检测不同物质(如过氧化氢、铜离子、铁离子等其他变价金属离子)的分析检测方法。不仅利于加深学生对于紫外-可见分光光度法的理解；还可作为设计实验，锻炼学生分析问题、解决问题的能力。本文将以铜离子检测为例，建立一种基于芬顿反应，采用紫外-可见分光光度法检测铜离子的本科教学实验。

1 实验部分

1.1 实验原理

1.1.1 铜基芬顿反应

Zhi Shan等[15]发现，氯离子可显著加速铜基芬顿反应，放大催化信号。在氯离子的加速作用下，铜离子催化过氧化氢，产生羟基自由基。

体系中羟基自由基将显色底物TMB氧化为蓝色的TMB+，后者在pH < 1的条件下，转变为稳定的TMB2+，如图1所示。TMB2+呈黄色，于452 nm附近有最大吸收。

图1 TMB氧化机理示意图[16]

1.1.2 紫外-可见光度分析及定量原理

当平行单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液的吸光度与其浓度间的关系满足Lambert-Beer定律[17]。其中，κ为摩尔吸收系数，b为吸收池厚度。

在相同波长下，溶液中吸光物质一定时，吸光度A与溶液浓度c成正比。

配制系列铜离子标准溶液，将其与待测样品在相同底物条件下进行芬顿反应；反应完成后，测定各体系紫外-可见吸收光谱，记录最大吸收波长所对应的吸光度值；绘制标准曲线，将待测样品吸光度值代入工作曲线方程中，完成定量分析。

1.2 实验仪器与试剂

1.2.1 实验试剂

超纯水，无水乙醇(分析纯，天津化学试剂厂)，硫酸铜储备液(以分析纯五水合硫酸铜配制，天津光复)，氯化钾(分析纯，天津光复)，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(分析纯，Adamas)，过氧化氢(30%，西陇化工)，硫酸(98%，西陇化工)，0.1 mol∙L−1pH = 4.5 HAc-NaAc缓冲液(以分析纯冰乙酸及乙酸钠配制，天津化学试剂厂)。

1.2.2 实验仪器

UV-2600紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，SYG-2数显恒温水浴锅(朗越，中国)，JP-010T超声波清洗机(洁盟，中国)。

1.3 实验步骤

1.3.1 反应试剂配制

1) 2.5、5.0、25.0 μmol∙L−1CuSO4∙5H2O储备液(由实验老师预先配制)。

2) 0.15 mol∙L−1KCl (aq)

准确称取1.1200 g KCl，在干燥的烧杯中加水溶解，转移至容量瓶，并用超纯水定容至100.00 mL，得0.15 mol∙L−1KCl (aq)。

3) 2.5 mmol∙L−1TMB

准确称取0.6000 g TMB于干燥烧杯中，加入适量无水乙醇，超声溶解，转移至100 mL容量瓶中，以无水乙醇定容，得25 mmol∙L−1TMB。再移取10.00 mL 25 mmol∙L−1TMB至100 mL容量瓶，以无水乙醇定容，最后得100.00 mL 2.5 mmol∙L−1TMB溶液。

4) 1.0 mol∙L−1H2O2

准确取10.00 mL 30% H2O2于容量瓶中，定容至100.00 mL，得1.0 mol∙L−1H2O2(aq)。

5) 5.5 mol∙L−1H2SO4

准确取30.00 mL 98% H2SO4于已加入了适量水的烧杯中，搅拌，冷至室温，转移至100 mL容量瓶，定容，最后得5.5 mol∙L−1H2SO4(aq)。

6) 模拟含铜废水样品(由实验老师预先配制，含铜6.0 μmol∙L−1)。

7) 0.1 mol∙L−1pH = 4.5 HAc-NaAc缓冲液(由实验老师预先配制)。

1.3.2 过氧化氢浓度对反应的影响

1) 取10个50 mL比色管，编号为空白、1–9。向各比色管中加入15.00 mL 5.0 μmol∙L−1Cu(II)、5.00 mL 0.15 mol∙L−1KCl (aq)、5.00 mL 2.5 mmol∙L−1TMB溶液，充分振荡摇匀。

2) 向1–9号中加入0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 1.0 mol∙L−1H2O2(aq)，向空白组中加入5.00 mL超纯水，后快速以缓冲溶液定容至50.00 mL，充分摇匀。

3) 将各比色管置于40 °C下水浴加热30 min，每组独立计时。

4) 反应完成后立即取出各比色管，加入5.00 mL 5.5 mol∙L−1H2SO4(aq)，终止反应，摇匀。

5) 测定各组紫外-可见吸收光谱，判断过氧化氢浓度对体系吸光度的影响情况。

1.3.3 反应动态过程测定

1) 取两个50 mL比色管，编号为1、2。向各比色管中加入15.00 mL 25 μmol∙L−1Cu(II)、5.00 mL 0.15 mol∙L−1KCl (aq)、5.00 mL 2.5 mmol∙L−1TMB溶液，充分振荡摇匀。

2) 向1号比色管中加入5.00 mL 1.0 mol∙L−1H2O2(aq)，以缓冲溶液定容至50.00 mL，充分摇匀，并在室温下反应10 min后，测定紫外-可见吸收光谱，确定TMB+的最大吸收波长。

3) 向2号比色管中加入5.00 mL 1.0 mol∙L−1H2O2(aq)，以缓冲溶液定容至50.00 mL，充分摇匀后，取1 mL该混合溶液加入比色皿中，测定混合溶液中TMB+最大吸收波长下的吸光度随时间变化曲线。

1.3.4 测定实验步骤

1) 取9个50 mL比色管，编号为空白、1–8，作为反应容器。其中，1–5号为标准系列(标准1–5)；6、7、8号为三组平行样品(样品1–3)。

2) 向空白组中加入5.00 mL超纯水，1–5号分别加入5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL，2.5 μmol∙L−1Cu(II)。

3) 向6–8组中各加入5.00 mL样品溶液。

4) 向各组中分别加入5.00 mL 0.15 mol∙L−1KCl (aq)。

5) 向各组中分别加入5.00 mL 2.5 mmol∙L−1TMB溶液，充分振荡摇匀。

6) 向各组中分别加入5.00 mL 1.0 mol∙L−1H2O2(aq)，后快速以缓冲溶液定容至50.00 mL。

7) 上一步加入过氧化氢后，立即开始计时(每组独立计时，如表1所示)，并逐组放入恒温水浴锅中，在40 °C下水浴加热30 min。

表1 实验计时方法

8) 各组反应完成后立即取出，迅速加入5.00 mL 5.5 mol∙L−1H2SO4(aq)，以终止反应，充分摇匀。

9) 测定各组紫外-可见吸收光谱，绘制工作曲线，计算样品中铜离子含量。

1.3.5 计时方法实例

2 实验结果讨论

2.1 过氧化氢浓度的影响

铜基芬顿反应主要与反应温度、反应时间、过氧化氢浓度、TMB浓度以及Cu(II)的浓度等因素有关。本实验以过氧化氢为例，对实验影响因素进行优化。固定其他反应条件，测定不同浓度过氧化氢对芬顿反应的影响。实验结果如图2(a)所示，过氧化氢浓度在0.00至0.02 mol∙L−1范围内时，吸光度随浓度增加而增加；当过氧化氢浓度超过0.02 mol∙L−1后，体系吸光度基本保持稳定。

2.2 反应动力学曲线测定

TMB+的最大吸收波长为654 nm，在此波长下测定反应动力学曲线。实验结果如图2(b)所示，随着铜基芬顿反应的进行，体系中生成的TMB+逐渐增加，检测液654 nm处的吸光度逐渐增大。随时间的推移，动力学曲线的斜率缓慢降低，可能是由于随着催化反应的进行，底物H2O2的浓度降低，产物TMB+浓度增加，加速了逆反应的进行，因此催化反应速率有所下降。

图2 过氧化氢浓度对体系吸光度的影响(a)及芬顿反应动力学曲线(b)

2.3 吸收曲线绘制(400–500 nm)

扫描1.3.4节中各组检测液的紫外-可见吸收光谱，实验结果如图3所示，检测液在452 nm处有最大吸收，且随检测液中铜离子含量增加，体系吸光度逐渐增大。

图3 采用芬顿反应体系检测不同铜离子标准溶液(a)及待测样品(b)的紫外-可见吸收光谱图

2.4 工作曲线绘制

由紫外-可见吸收光谱可知，体系最大吸收波长为452 nm。如表2所示，记录体系中铜离子终浓度(以体系为50.00 mL时计算)以及对应的检测液在452 nm处的吸光度值(A452nm)。并以A452nm作为纵坐标，铜离子浓度作为横坐标作图，绘制工作曲线(图4)。

图4 铜离子检测工作曲线

表2 标准溶液中铜离子浓度-吸光度数据表

工作曲线方程为y= 0.3636x+ 0.2575，相关指数R2= 0.9987，线性关系良好，实验稳定性较好。

2.5 样品浓度测定

记录452 nm下，样品体系吸光度值(表3)，代入工作曲线方程，得出体系为50.00 mL时，样品中铜离子浓度，并据此计算稀释前原始样品中铜离子浓度(表4)。

表3 平行样品浓度计算

表4 样品原始浓度计算及误差分析

结果表明，模拟废水样品中铜离子平均原始浓度为5.86 μmol∙L−1，与预设值相近，相对误差为2.33%，测定结果较准确。三次检测的相对标准偏差为1.50%，满足仪器分析实验基本要求。

2.6 讨论

本实验误差主要来自以下方面：一是溶液配制误差，二是溶液移取误差，三是反应时长误差，四是仪器系统误差。实际操作本实验时，实验者需准确配制溶液及移取试剂，还需尽可能按照实验方法准确计时，以确保各组反应时长一致。

2.7 注意事项

1) 反应需尽量准确计时，以尽可能保证各组反应时长一致，减小误差；

2) 需注意TMB、H2O2的低温避光保存，最好现配现用；

3) 因盐酸溶液中，氯离子含量较高，本实验不宜换用盐酸来终止反应。

3 实验条件讨论

3.1 氯离子加速铜基芬顿反应

铜基芬顿反应体系中，氯离子的存在可以显著加速铜基芬顿反应[15]。我们比较了不同浓度氯离子对铜基芬顿反应的放大效果，实验结果如图5(a)所示，在1.5 μmol∙L−1铜离子的存在下，随着氯离子浓度的增加，检测液452 nm处的吸光度逐渐增大(红色柱状图)；当体系中不含铜离子时，TMB2+452 nm处的吸光度较小(黑色柱状图)，证明氯离子的存在可以加速铜基芬顿反应。

3.2 方法的选择性

为了考查方法的选择性，采用该方法对相同浓度的其他几种常见的金属离子进行检测，所得到的实验结果如图5(b)所示，这些干扰物所得到的检测信号较小，只有Cu(II)的存在才能够使检测液在452 nm处产生较大的信号。虽然Fe(II)等变价金属也能够催化芬顿反应，但是由于铜基芬顿反应的反应速率更快，且氯离子的存在进一步加速了铜基芬顿反应，所以该方法具有较好的选择性。

图5 不同浓度氯离子对反应的影响(a)及几种常见金属离子对反应的影响(b)

4 特点及特色声明

向本科生介绍了该种快速、简单、可操作性强的铜离子检测方法，使其认识、理解并实际操作芬顿反应，同时帮助学生学习掌握紫外-可见分光光度法。

1) 本实验安全，可重复性强，操作方便，适用于本科教学；

2) 实验稳定性好，重现性较强；

3) 反应试剂毒性较小，相对安全；

4) 经改进后，可设计成用于Fe2+、Cl−、H2O2等物质测定的检测实验。

5 结语

本实验简单快捷，重现性较好，对铜离子的检测相对准确。向本科生介绍芬顿反应-TMB显色体系，并实际应用其完成定量分析，拓宽实验者知识面。此外，本实验采用紫外-可见分光光度法进行测定，有利于帮助学生巩固课程知识，掌握仪器结构与操作[18]，一定程度上有助于教学改革的落实[19]。本实验还可以拓展设计成用于检测芬顿反应体系中其他物质(如：过氧化氢、铁离子等)的本科教学实验。