不同贮藏温度和时间对思茅松花粉活力的影响

付 强，陈 伟，李 江，冯 弦，史富强，陈绍安

（1.云南省林业和草原科学院，云南昆明 650201；2.普洱市林业和草原种苗工作站，云南普洱 665000；3.普洱市林业科学研究所，云南普洱 665000）

思茅松（Pinus kesiyavar.langbianensis）是一种乡土材脂兼用树种，主要分布在云南省哀牢山以西的南亚热带山区，具有生长快、耐贫瘠、材质优和产脂高等特点，是云南林产业的明星树种[1]。围绕思茅松已形成林化、林板及林桨纸等产业[2]。目前，思茅松的研究主要集中在人工林培育[2]、生态学[3]、碳汇计量[4]和功能基因的克隆与分析[5]等方面，在良种选育方面较为滞后，仍处于一代种子园阶段，与马尾松（Pinus masonnianna）、杉木（Cunninghamia lan⁃ceolata）等全面进入高世代育种的针叶树种相比，差距较大，不能有效地支撑思茅松下游相关产业的快速发展。

杂交育种是培育新品种最有效和最常用的手段之一[6]，是思茅松种质创新的一条重要途径，也是高世代育种的基础。花粉是种子植物在自然条件下遗传信息交流的载体[7-9]，花粉受精过程能否顺利完成是植物杂交育种的关键。在实践过程中，计划进行的交配经常会遇到花期不遇的问题，或需要在异地开展杂交工作，对花粉进行有效的保存至关重要，花粉的研究也成为遗传改良的重要研究内容之一。评价花粉保存成效的最有效手段是测定花粉活力。目前，对于思茅松花粉的研究，仅见陈伟等[10]对思茅松花粉离体萌发条件的研究，以及付强等[11]对思茅松花粉快速测定方法的比较，尚未见有关思茅松花粉贮藏方法的研究报道。本研究在优化思茅松花粉活力测定方法的基础上，对思茅松花粉贮藏条件进行探索，旨在为思茅松杂交育种工作的顺利开展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

思茅松花粉来源于云南省景谷县文郎林场思茅松无性系种子园（100°29′E，23°29′N），于2003年7月建成，海拔1 600 m。花粉成熟后会从雄球花上自然散落，依此判断花粉的成熟度并采集材料。2019年2月，从同一植株4 个方位枝条上采集顶端开始散粉的雄球花，将雄球花放入大号纸袋中带回实验室，在硫酸纸上摊开，自然阴干散粉，过筛后的花粉经硅胶干燥72 h后储存于密封瓶中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉萌发率测定时间的确定

采用离体培养法测定萌发率，培养基为100 mg/L H3BO3溶液。以当年新鲜的思茅松花粉为材料，在2 mL 的离心管中加入1 mL 的培养基，再加入10 mg花粉，震荡离心管，让花粉粒与培养液充分混合，随后将离心管置于28 ℃的培养箱中暗培养12、24、36、48、60 和72 h 后取样，震荡离心管，用吸管吸取样品置于载玻片上，盖上盖玻片进行镜检[10]。观测花粉的萌发过程，统计萌发率，测量花粉管长度，确定测定的最佳时间。每处理设4个重复。

1.2.2 贮藏条件对花粉萌发率的影响

将新鲜制备好的花粉分装于底部放有变色硅胶的密封瓶中，标记后分别置于常温（室温）、4、-18和-80 ℃条件下保存，0.5年和1年后分别取样，于28 ℃恒温箱暗培养48 h，统计花粉的萌发情况。每处理设4个重复。以贮藏前的花粉萌发率测定值为对照（CK）。

1.2.3 指标测定

采用Leica显微镜（DM2500，德国）进行镜检，使用其自带的数码成像系统进行拍照，每张样片随机观察4 个视野，单个视野花粉数量大于50 粒。当花粉管长度大于花粉粒直径时为花粉萌发，花粉管长度是花粉萌发的判断依据，也是判断花粉活力大小的重要指标。利用成像系统自带的测量工具测量萌发花粉粒的花粉管长度。

花粉萌发率= 观察视野萌发的花粉数/观察视野花粉总数×100%

1.3 数据处理

采用Excel 软件进行处理与分析，采用DPS 18.10软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 思茅松花粉萌发率测定时间

12 h可观测到思茅松花粉萌发，萌发率为4.8%；随着培养时间的延长，萌发率逐渐升高，36～48 h 急剧升高，48 h 后趋于平稳，48、60 和72 h 的萌发率差异不显著（表1）。12 h 萌发花粉粒花粉管的平均长度为55.1 μm（花粉粒的平均直径为49.8 μm）；随着培养时间的延长，花粉管的长度不断伸长，48 h 萌发花粉粒花粉管的平均长度为98.1 μm，约为花粉粒直径的2 倍；72 h 萌发花粉粒花粉管的平均长度为182.8 μm；48 h后萌动的花粉粒，花粉管长度较少能达到萌发标准。

表1 思茅松花粉在不同培养时间的萌发情况Tab.1 Pollen germination of P.kesiya var.langbianensis in different culture time

2.2 贮藏条件对花粉萌发率的影响

0.5年时，4 种贮藏方式的花粉萌发率均有不同程度的降低（表2）。其中，常温干燥贮藏的花粉萌发率最低（19.2%），比CK（图1a）降低69.7%；随着温度的降低，花粉萌发率逐渐升高，超低温（-80 ℃）干燥保存的花粉相对不容易失活，与CK 相比降低29.8%～36.1%（图1b～e）。方差分析和多重比较表明，不同贮藏方式间的花粉萌发率差异极显著（P＜0.01），3 种低温干燥贮藏方式间的花粉萌发率差异不显著。

表2 不同贮藏方式花粉萌发率（0.5年）Tab.2 Pollen germination rate of different storage methods(0.5 years)(%)

1年时，4 种贮藏方式的花粉萌发率大幅降低（表3）。其中，常温干燥贮藏的花粉萌发率仅为2.3%，与0.5年时相比降低88.0%，与CK 相比降低96.4%，绝大多数花粉已经失去活力；超低温干燥贮藏的花粉萌发率仅为25.5%，3种低温干燥贮藏的花粉萌发率与CK 相比分别降低了63.7%、63.7%和59.7%（图1f～i）。方差分析和多重比较显示，各处理间差异极显著（P<0.01），3 种低温干燥贮藏方式间的花粉萌发率差异不显著。

表3 不同贮藏方式花粉萌发率（1年）Tab.3 Pollen germination rate of different storage methods(1 year)(%)

图1 不同贮藏方式思茅松花粉萌发情况（28 ℃，48 h）Fig.1 Pollen germination of P.kesiya var.langbianensis in different storage methods(28℃,48 h)

3 讨论与结论

花粉活力测定常用的方法有染色法和离体萌发法。染色法具有简便快速的特点，但准确性差[12]；离体萌发法根据花粉离体培养时的萌发率判断其生活力[13]，被认为是花粉活力测定最可靠和稳定的方法[14]。离体萌发法中，影响花粉萌发的因子较多，如培养基成分、pH值、培养温度和时间等，筛选出最优的培养条件需进行大量试验；其次，离体萌发法进行花粉测定所需时间较长，在确保准确性的前提下，尽可能地缩短测定时间，是离体萌发法需要优化的方向。本研究在初步优化出最适培养基的基础上，探讨测定萌发率的最佳时间。48 h 前花粉的萌发率持续增加，48 h后花粉萌发率无显著变化，说明花粉粒萌发高峰已过。继续观察48 h 后花粉的萌发形态，发现新萌动的花粉粒极少，且花粉管长度未达到萌发标准，说明新萌发的花粉粒较少；48 h后花粉管开叉生长且交错的几率增加，导致无法测量花粉管长度。从另一方面说明48 h 为统计花粉萌发率的重要时间节点。48 h时花粉管长度接近花粉粒直径的两倍，能直观地从花粉管长度判定花粉萌发情况，也能准确测量花粉管长度，所以48 h 是本试验最佳的花粉活力测定时间。

花粉活力的保持一方面由遗传因素所决定，另一方面受环境因素的影响[15]。有些物种的花粉在适当的温度和干燥条件下可以保存数年[16]，如细叶按（Eucalyptus tereticornis）花粉经干燥和抽真空处理，在-18～-20 ℃条件下贮藏42 个月后萌发率仍能达到66.4%[17]；松属的班克松（P.banksiana）在2 ℃和25.75%相对湿度条件下贮藏1年后，其花粉萌发率几乎无变化[16]；汪企明等[18]对松属6种松树花粉的研究表明，干燥后的花粉在低温、真空条件下贮藏6个月后，花粉萌发率的降幅均低于5%，16 个月后花粉萌发率降幅达11%～55%，说明条件适宜时，松树花粉可长时间贮藏。本研究的思茅松花粉在低温干燥条件下贮藏6 个月后，花粉萌发率降低29.8% ～36.1%，远高于汪企明等[18]的研究结果，可能是因为树种的差异，也可能是贮藏条件中氧气含量的差异所致。本研究的所有贮藏方式均未进行抽真空处理，呼吸作用是细胞有活性的一个特征，氧气含量的降低会抑制花粉粒的呼吸作用，能延长花粉寿命，推测低温、干燥和低氧环境可能是延长思茅松花粉贮藏时间的关键因子。

思茅松花粉在低温干燥条件下贮藏1年后，花粉萌发率可保留25%左右，相较于贮藏前，虽然花粉萌发率降低达63.7%，但仍然具有一定的应用前景。松属植物在开展人工辅助授粉时，鲜花粉常添加填充剂，花粉与填充剂的比例为2∶8 或3∶7[16]，保存的松属植物花粉萌发率与思茅松低温干燥保存1年后花粉萌发率相近，说明低温干燥保存方式已能满足生产上的使用，当花粉需要隔年使用时，可使用该简易方法进行花粉贮藏。

以100 mg/L H3BO3溶液为萌发培养基，在28 ℃恒温条件下暗培养，12 h 可观测到思茅松花粉粒萌发，48 h后花粉萌发率趋于平稳，且具有较好的花粉萌发识别度，48 h 是该试验条件下花粉活力测定的最佳时间。4 种方式贮藏1年后，花粉活力降低59.8%～96.4%，低温干燥相较于常温干燥更有利于思茅松花粉萌发率的保持，3 种低温干燥贮藏方式间花粉萌发率的差异不显著，低温干燥保存1年的思茅松花粉萌发率能满足生产的要求。