新疆杏果实发育成熟进程中乙烯合成规律

徐 敏，周伟权，赵世荣， 潘 俨，樊国全，章世奎，王亚铜，廖 康

(1.新疆农业大学特色果树研究中心/林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学研究院农产品贮藏加工所，乌鲁木齐 830052；3.新疆农业科学研究院轮台果树资源圃，新疆轮台 841600)

0 引 言

【研究意义】杏(Prunus armeniaca L.)是重要的经济果树树种。杏果实属于呼吸跃变型果实，对乙烯极为敏感，乙烯高峰的出现是果实成熟和衰老的重要标志之一[1,2]。在呼吸跃变果实中，乙烯的释放量在成熟开始阶段急剧增加，而成熟的过程中乙烯起关键作用[3,4]。乙烯的合成规律决定杏果实的成熟进程和衰老速度，严重影响杏的采收和采后贮藏品质等。呼吸跃变型果实的乙烯合成分2个系统进行，系统I负责果实在成熟前的少量乙烯生产，系统II负责果实成熟过程中乙烯的自催化上升[5]。系统地研究杏果实在发育进程中乙烯的合成规律，尤其是系统Ⅰ中少量乙烯产生的时间和释放量对于探明杏果实成熟衰老机制有着重要意义。【前人研究进展】目前关于杏果实乙烯方面的研究多集中在采后杏果实乙烯合成代谢的调控研究[6,7]，采后不同处理对杏果实乙烯代谢影响的研究[8-10]，【本研究切入点】对于杏果实发育进程中乙烯的合成规律，及其对杏果实的成熟和衰老调节未有研究报道。研究新疆杏果实发育成熟进程中乙烯合成规律。【拟解决的关键问题】新疆轮台白杏、 库车白杏和库买提 3个品种果实发育进程中，研究测定内源乙烯合成途径的中间产物含量和相关酶活性、乙烯释放量、呼吸速率等，分析乙烯合成变化规律及其与果实成熟间的关系，为解析杏果实成熟进程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

以轮台白杏、 库车白杏和库买提3个品种新疆杏果实为材料。3个品种杏成熟期硬度差异大且生长发育期一致。材料均取自新疆农科院轮台县果树资源圃，株行距为4 m×6 m，东西行向，采用常规肥水管理。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集与处理

3个品种杏果实从盛花后14 d进入幼果期，每隔7 d采集1次果实样品，至果实完全成熟，共10个时期；每个品种选择3个样株上大小和外形一致果实，一部分果实用于鲜样指标测定，一部分样品果肉切成小块混装，立即放入液氮中，-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 测定指标

(1)果实可溶性固形物含量

每个重复随机取10个果实，用手持糖度计(日本Atago，型号PAL-1)读取果实汁液中可溶性固形物含量(%)。

(2)果实硬度

每个重复随机取10个果实，削去果实赤道部位表皮，用GY-1型果实硬度计分别测定果实阳面和阴面果肉的硬度(kg/cm2)，每个样品重复10次。

(3)果实呼吸速率

采用静止滴定法[11]。取200 g杏果实放置于干燥器中，干燥器底部放入定量碱液，果蔬呼吸放出的CO2自然下沉而被碱液吸收，静置1 h后取出碱液，用草酸滴定，计算出样品在呼吸过程中释放出的CO2的量(mg CO2h/kg)，每个样品重复3次。

(4)果实乙烯释放量

参照Qin等方法[12]，略有改进。取0.5 kg杏果实放置在2.25 L的密封容器内密闭1 h，抽顶空气体1 mL，通过气相色谱(安捷伦7890B GC型气相色谱仪)进行测定。每个样品设3组重复。

(5)果肉组织中1-氨基环丙烷1-羧酸(ACC)、甲硫氨酸(Met)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量

参考Hans Kende的方法[13]，将杏果肉置于液氮中充分研磨粉碎，称取0.1 g样品，加入样品体积9倍的磷酸缓冲液(pH 7.4)进行提取，于4℃、8 000 r/min离心30 min，取上清液进行ACC含量的测定。使用Elisa试剂盒(瑞朔公司生产)进行显色反应，在酶标分析仪Rayto RT-6100下测定。每个样品设3组重复。Met和SAM的测定方法均参考ACC的测定方法。

(6)果肉组织中ACC合成酶(ACS)与ACC氧化酶(ACO)活性

参考Hans Kende的方法[13]，将杏果肉置于液氮中充分研磨粉碎，称取0.1 g样品，加入样品体积9倍的4℃预冷磷酸缓冲液(pH 7.4)进行提取，于4℃、8 000 r/min离心30 min，上清液即为酶提取液。分别采用植物ACC合成酶(ACS)ELISA检测试剂盒、植物ACC氧化酶(ACO)ELISA检测试剂盒(瑞朔公司生产)进行显色反应后，在酶标分析仪Rayto RT-6100下测定。每个样品设3组重复。

1.3 数据处理

图表采用Excel WPS进行绘制，数据分析采用SPSS16.0单因素方差分析(ANOVA)，利用Duncan多重比较对差异显著性进行分析，用Pearson进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 杏果实成熟进程中部分指标和乙烯释放量的变化

研究表明，3个品种杏果实的单果重在整个发育成熟进程中呈单“S”曲线。整个发育成熟过程中单果重呈现出库买提>库车白杏>轮台白杏，其中库买提的单果重和其他2个品种差异性显著(P<0.05)。

3个品种杏的可溶性固形物含量在花后14～42 d增加量差异性不显著(P>0.05)。花后49～77 d 3个品种杏各时期之间的可溶性固形物含量差异性显著(P<0.05)。库车白杏可溶性固形物含量呈现大幅度增加直至花后70 d达到最大25.8%。轮台白杏和库买提的可溶性固形物的含量均呈现出上升趋势，直至花后77 d达到最大。

3个品种杏的呼吸速率变化呈现出双峰曲线，第一个峰值出现在花后42 d，与微量乙烯生成的时间一致；第二个峰值出现在花后70 d，与大量乙烯生成时间基本一致。3种杏果实的呼吸速率变化方面，3个品种杏在21～35 d期间的呼吸速率的差异性不显著，花后42～77 d期间的不同时期的呼吸速率的差异性显著(P<0.05)。库车白杏的2个呼吸速率的峰值高于其他2个品种峰值且差异性显著(P<0.05)。

3个品种杏果实乙烯释放量增加的趋势分为3个阶段，分别是14～28 d、35～49 d和56～77 d。35～49 d属于微量乙烯的生成期；56～77 d是大量乙烯生成期，不同品种杏果实在3个阶段的乙烯释放量的差异性显著(P<0.05)，库买提和库车白杏在不同发育阶段的乙烯释放量和变化接近，轮台白杏在49～77 d的乙烯释放量和其他2种杏同时期的乙烯释放量相比较呈显著性差异(P<0.05)。轮台白杏花后77 d乙烯释放量是其他杏果实同时期乙烯释放量的2倍。

杏果实硬度的变化趋势均表现出随着发育进程不断降低。3个品种杏果实的硬度均在花后42 d之后开始出现下降，3种杏果实硬度在49～77 d期间下降幅度达65%以上，49～77 d主要是3种杏果实的转色期至成熟期。图1

3个品种杏果实的乙烯释放量分别与可溶性固形物含量、果实硬度、呼吸速率和单果重的相关性存在一定区别，轮台白杏和库买提乙烯释放量与可溶性固形物含量、果实硬度、呼吸速率呈极显著相关(P<0.01)，和果实硬度呈极显著负相关(P<0.01)；库车白杏乙烯释放量与果实硬度和呼吸速率呈极显著相关(P<0.01)，与果实可溶性固形物含量呈现显著相关(P<0.05)，和果实硬度呈极显著负相关(P<0.01)。表1

图1 A～D 3个品种杏单果重、SSC、呼吸速率、硬度和乙烯释放量的变化Fig.1 A-D Changes in single fruit weight, SSC, respiration rate, firmness and ethylene release of 3 cultivars of apricot

表1 3个品种杏果实乙烯释放量和果实部分指标间相关性Table 1 Correlation analysis between ethylene release and fruit indexes of 3 cultivar apricot fruits

2.2 杏果实生长发育成熟过程中乙烯合成途径中主要物质含量变化

研究表明，不同杏品种之间也存在种间差异。在花后49～77 d间，库买提杏果实的Met含量最低；在14～42 d间(果实发育前期)，库车白杏中Met含量最高，而轮台白杏的含量最低；42～77 d(果实发育的后期)，轮台白杏的Met含量增长幅度较其他2种杏的更显著，其花后77 d的Met 含量是21 d的2倍多，且为三者中的最高。

轮台白杏果实中SAM含量在花后14～42 d的差异性不显著(P>0.05)，而在花后49～77 d呈现显著性差异(P<0.05)。库车白杏生长发育前期的SAM 含量在3种杏中较高，但在花后42 d出现一定下降，在花后63 d达到最大值226.663 ng/g FW，和其他时段呈现显著性差异(P<0.05)。库买提在生长发育前期即花后14～42 d的SAM含量呈现显著上升趋势(P<0.05)。

3个品种杏果实在不同发育阶段，果肉组织中的ACC含量在不同时期存在显著性差异(P<0.05)，均表现出随着发育进程ACC含量总体呈现增加的趋势。轮台白杏在生长发育过程中，ACC含量的变化分为2个阶段：花后14～42 d呈现逐渐上升的趋势，从花后49～77 d呈现缓慢上升的趋势，花后77 d达到最大。库车白杏生长发育期的ACC含量在3个品种杏中14～35 d处于中间水平，但在花后42 d出现一定下降，49～70 d的ACC含量最高。图2

2.3 杏果实生长发育成熟过程中乙烯相关酶活性的变化

研究表明，3个品种杏的ACS 酶活性在不同时期的表现并不一致，轮台白杏果肉中ACS酶活性在不同时期差异性显著(P<0.05)，花后77 d和其他时期相比较达到极显著性差异(P<0.01)，花后77 d ACS活性出现急剧上升的现象，较前一时期增长幅度达25.3%，与其他2种杏的ACS活性存在显著性差异。库买提和库车白杏均呈现出逐步上升的趋势。

3个品种杏果实在不同生长发育阶段，果肉组织中的ACO活性在不同时期存在显著差异(P<0.05)，均表现出随着发育进程ACO活性不断增加的趋势。轮台白杏果肉组织中的ACO活性整体呈上升规律，轮台白杏的ACO活性在花后77 d时达到峰值，与其他时期均呈显著性差异。库车白杏的ACO酶活性的增加趋势分为2个阶段：14～35 d的ACO酶活性的差异性显著，49～77 d的ACO酶活性呈现差异性则不显著。图3

图2 A～C杏果实发育过程中Met、SAM、ACC含量的变化Fig.2 Changes of Met、SAM、ACC content in fruit development of apricots

图3 A～B杏果实发育过程中ACS、ACO活性的变化Fig.3 Changes of ACS and ACO in fruit development of apricots

2.4 杏果实乙烯释放量、ACC、Met、SAM、ACS和ACO相关性

研究表明，轮台白杏乙烯释放量和乙烯代谢酶(ACS、ACO)之间呈现极显著相关(P<0.01)，轮台白杏乙烯释放量和乙烯合成前提物质含量(SAM、Met、ACC)之间呈现极显著相关(P<0.01)，且乙烯合成前提物质含量(SAM、Met、ACC)和乙烯代谢酶(ACS、ACO)之间也呈现极显著相关(P<0.01)。表2

表2 轮台白杏乙烯释放量和代谢酶活性及前体物质含量的相关性Table 2 Correlation analysis of ethylene, enzyme activity and precursor substance content of ‘luntaibaixing’

研究表明，库车白杏乙烯释放量和乙烯代谢酶(ACS、ACO)之间呈现极显著相关(P<0.01)，库车白杏乙烯释放量和乙烯合成前提物质中Met含量呈极显著相关(P<0.01)，且乙烯合成前提物质Met和ACC的含量和乙烯代谢酶(ACS、ACO)之间也呈现极显著相关(P<0.01)。表3

表3 库车白杏乙烯释放量和代谢酶活性及前体物质含量的相关性Table 3 Correlation analysis of ethylene, enzyme activity and precursor substance content of kuchebaixing

研究表明，库买提乙烯释放量和乙烯代谢酶(ACS、ACO)之间呈现极显著相关(P<0.01)，库买提乙烯释放量和乙烯合成前提物质SAM和Met含量之间呈现极显著正相关(P<0.01)，且乙烯合成前提物质含量(SAM、Met、ACC)和乙烯代谢酶(ACS、ACO)之间也呈现极显著正相关(P<0.01)。表4

3 讨 论

3.1 杏果实乙烯的合成规律

植物激素乙烯在呼吸跃变型果实的成熟和品质形成过程中起重要作用，对影响果实成熟进程及贮藏期的变化起着关键作用[14]。在前人关于跃变型果实的乙烯生物合成代谢的研究中指出乙烯代谢分为2个系统，系统Ⅰ是微量乙烯的产生，系统Ⅱ是在少量乙烯的催化作用下生成大量乙烯[15]。研究中在杏果实生长发育过程中花后42～49 d(转色期)属于系统Ⅰ有少量乙烯生成的阶段，花后49～77 d(成熟期)属于系统Ⅱ在少量内源乙烯的自我催化作用下合成大量乙烯的阶段，加速了杏果实成熟和衰老的进程。和前人关于呼吸跃变型果实的乙烯代谢研究结论一致[16]。

3.2 乙烯对杏果实呼吸速率、硬度和可溶性固形物的影响

呼吸跃变型果实出现呼吸跃变标志着果实进入完熟期。杏果实是典型的呼吸跃变型果实，具有明显的呼吸峰和乙烯释放高峰。有研究表明，乙烯促进果实呼吸作用[17]，3种杏果实的乙烯产生时间均在49 d即转色期，3种杏果实转色期后49～70 d进一步成熟，在此过程中乙烯一方面通过其受体与细胞膜结合，使细胞膜透性增高，从而加快淀粉的分解和可溶性糖的转运，提高了细胞中呼吸底物的浓度；另一方面通过诱导相关基因的表达，提高呼吸酶的含量和活性[17]，使果实的呼吸速率急剧增加达到呼吸跃变。研究中乙烯的大量产生时间和呼吸峰值出现的时间较为一致，3种杏果实乙烯的产生均促进呼吸速率的增加。研究中还发现呼吸速率的第二次峰值比乙烯释放峰值早，而在朱璇[18]、吴芳等[19]关于赛买提杏的呼吸速率峰值比乙烯释放峰值出现的时间晚，原因可能是研究3种杏果实属于采样后直接测定，而赛买提杏的研究是采后经过处理再测定。

研究中，杏果实的硬度均伴随着少量乙烯的产生开始逐渐下降，直至呼吸速率峰值出现前后果实硬度出现急剧下降，在乙烯释放量达到峰值时3种杏果实硬度最小，与Wang等[8]在赛买提杏乙烯合成的研究中关于随着采后杏果实乙烯释放峰值的出现，杏果实硬度出现急剧下降的研究结果一致。果胶甲基酯酶(PME)和糖苷酶活性在果实硬度下降过程中起着关键作用，它们与乙烯的产生密切相关，且在极低水平的乙烯水平下被激活[6]。杏子在贮藏成熟过程中硬度下降是一个高度依赖乙烯的过程，即使乙烯浓度非常低也能受其影响[20]。研究中3种杏果实的硬度也受乙烯释放规律的影响，和乙烯释放量密切相关，与贾展慧等[21]在槜李果实采后软化过程中乙烯生物合成变化的研究中得出的关于乙烯释放高峰和果实硬度的结论一致。轮台白杏是3个品种杏中成熟期硬度最低的品种，导致轮台白杏极不耐运输和贮藏。

可溶性固形物(SSC)是决定果品食用质量的重要因素之一，糖是主要组成成分，糖含量直接关系到果实的甜度及风味[22]。SSC在成熟过程中会增加，因为淀粉通过呼吸等分解代谢过程水解成单糖[23]。有研究指出乙烯释放量对采后果实的SSC没有影响[24]，但在研究中3种杏果实在生长发育进程中随着乙烯释放量的增加SSC有显著增加，尤其是生长发育后期。SSC显著增加原因和呼吸速率及乙烯代谢相关。

3.3 杏果实中乙烯代谢酶活性和代谢物质的变化规律

3个品种杏果实乙烯合成代谢物质在生长发育初期的含量存在显著性差异是由杏品种本身的遗传特性决定。杏果实的乙烯代谢是由Met经SAM合成酶催化生成SAM，再经过ACS催化生成ACC，之后经ACO催化生成乙烯[23]。Met、SAM和ACC都是乙烯代谢过程中产生的代谢物，杏果肉组织中3种代谢物质的含量变化在生长发育过程中分为2个阶段，第1个阶段14～49 d即幼果期到转色期，该阶段果实乙烯合成过程中的代谢物质呈现逐渐缓慢上升的趋势，库车白杏在花后42 d 3种代谢物含量均有下降，和其他2种杏表现出不同。第1阶段和乙烯合成系统Ⅰ少量乙烯合成相对应。第2个阶段花后49～77 d即转色期至成熟期，3种杏果实的乙烯合成代谢物质的变化表现出不同的趋势，轮台白杏和库买提表现为大幅增加的趋势至77 d达到峰值，库车白杏则表现为先增加再降低的趋势。第2阶段和乙烯合成系统Ⅱ大量乙烯合成相对应。SAM和Met不仅是乙烯的合成前体物质它们还参与其他生理过程，其含量在第1阶段也存在一定的变化。ACC的合成量在花后42 d有大幅增加说明其生物合成途径被激活，主要受ACS活性的影响，也有研究指出较高的ACC含量与高浓度的IAA对ACS酶活性的刺激作用有关[25, 26]。

研究中杏果实的乙烯代谢酶ACS和 ACO的活性在整个生长发育过程中呈现出上升趋势，且在成熟阶段上升幅度最大，和杏果实成熟期乙烯释放速率变化趋势较为一致，2种酶在杏果实乙烯合成代谢中都起到重要作用。这与Yang等[15]在研究几种呼吸跃变型果实完熟时ACS和ACO的活性都增加，以及阚娟等[22]在李果实的乙烯合成变化研究关于ACS和ACO的活性的结论一致。库买提花后42～77 d的ACS和ACO活性均比其他2种杏果实高，但是乙烯释放量却是最低的，原因是由于库买提果肉组织中含有的SAM转变为ACC的同时还转化为MACC从而进入乙烯系统Ⅰ循环[27]，导致库买提中ACC含量最低，这也是其乙烯释放量低的原因。在此期间可考虑通过外施水溶性ACC以提高库买提的乙烯释放量[28]。

4 结 论

3个品种杏果肉组织中的可溶性固形物含量的变化趋势较为一致，均表现出随着发育进程不断增加的趋势。杏果实在不同发育阶段，果实中的乙烯释放量变化趋势较为一致，均表现出随着发育进程不断增加的趋势。3种杏果实在转色期至成熟期伴随着乙烯释放量的增加果实硬度迅速下降。轮台白杏随着乙烯释放量增加幅度最大，其硬度下降幅度也最大，降幅达76%。轮台白杏在花后77 d成熟期的硬度显著低于同时期另外2种杏果实的硬度(P<0.05)。2个品种白杏在乙烯释放量和SSC含量的相关性上存在差别，3个品种杏果实的乙烯释放量和发育成熟相关指标间密切相关，乙烯释放量对果实成熟至关重要。3个品种杏果实在不同发育阶段，果肉组织中的Met含量存在显著差异(P<0.05)，但Met含量变化趋势相似，均表现为不断增加。杏果实在不同发育阶段，果肉组织中SAM含量总体变化趋势存在区别。在3种杏果实中，轮台白杏和库买提果实的SAM含量在花后77 d达到最大。库买提在生长发育的ACC含量最低。

ACS和ACO是乙烯合成途径中的关键酶和限速酶。3个品种杏果实中 ACS 酶活性水平在整个生长发育过程中均呈现出逐渐上升的整体趋势。3个品种杏的ACS活性由大到小依次为：库买提>轮台白杏>库车白杏。3个品种杏果实的ACO酶活性水平呈现出：库买提>轮台白杏>库车白杏。轮台白杏乙烯代谢过程中的物质、酶活性和乙烯释放之间是互相影响缺一不可的。

3个品种新疆杏在成熟进程中，微量乙烯产生生成时间在花后42～56 d。果肉组织中的乙烯合成前体物质的变化趋势分2个阶段，且基本呈增加趋势，3个品种的增加幅度存在显著差异。不同生长阶段，新疆杏果实在发育中的ACS和ACO活性的逐渐增大与乙烯释放量的不断增加相一致，且呈现出极显著相关。乙烯调控杏果实的成熟，使杏果实的硬度显著下降、可溶性固形物含量增加及出现呼吸跃变。