血清miR-26水平及其与miR-21、miR-141联合检测对老年结肠癌患者的诊断及预后预测的价值

张雅静 杜昆利

结肠癌是常见的消化系统肿瘤之一，其发病率居全球恶性肿瘤第3位[1]。早期结肠癌患者临床症状不明显，多数患者确诊时处于晚期，术后的5年生存率较低[2]。研究报道，全球每年约有120万以上的结肠癌新发病例，约有60万人死于结肠癌[3]。在中国，近年来由于人们生活方式的改变，结肠癌发病率及病死率均呈升高趋势[4]。目前缺乏敏感度和特异度均较高的结肠癌早期诊断标志物。随着对结肠癌发病机制的深入研究，探索与结肠癌发生、发展相关的生物标志物对于早期诊断和治疗结肠癌，以及改善患者的预后具有重要的意义。

miRNA是广泛存在于生物体内的非编码RNA，其作为一类重要的基因表达调控因子，可与靶基因结合，调控与肿瘤细胞生长相关基因的表达[5-7]。miRNA不仅可作为肿瘤早期诊断、治疗和预后预测的生物标志物，还可作为治疗靶点[8]。miR-26位于19q14.12染色体，有研究报道其在多种恶性肿瘤中异常表达，参与调控肿瘤细胞的生长、迁移、转化、侵袭等过程，且与患者的临床病理特征及预后密切相关，目前其在结肠癌发生、发展中的作用尚未完全明确[9-11]。本研究探讨了血清miR-26水平与老年结肠癌患者临床病理特征及长期预后的关系，以期为结肠癌的早期诊断及预后预测提供有价值的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013年3月至2015年3月空军军医大学第一附属医院消化科收治的45例60岁及以上的结肠癌患者作为结肠癌组，另选择同期50名60岁及以上的健康体检者作为对照组。本研究获得医院医学伦理委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。纳入标准：(1)结肠癌患者均为首诊，行结肠镜检查，活体组织病理确诊为结肠癌；(2)对照组行结肠镜检查未见异常，且无恶性肿瘤病史；(3)年龄≥60岁。排除标准：有高血压、糖尿病及心血管、肝、肾等慢性疾病患者，严重烟、酒嗜好者。结肠癌组中，男性27例(60%)，女性18例(40%)，年龄60～79岁，平均年龄为(68.22±12.11)岁；对照组中，男性28例(56%)，女性22例(44%)，年龄60～81岁，平均年龄为(67.41±12.43)岁。两组的性别、年龄差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2 主要仪器与试剂

miR-21、miR-26及miR-141引物由广州锐博生物公司合成；RT-PCR仪器(ABI VeritiPro PCR)购自美国Thermo Fisher公司；总RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript○RRT reagent Kit和qPCR试剂盒SYBR Green qPCR assay均购自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

收集两组的临床资料，包括性别、年龄及临床病理特征等。结肠癌组于术前1周抽取5 mL外周静脉血，对照组于体检当日清晨抽取5 mL外周静脉血。将外周血置于离心机中，2 000 r/min离心10 min，分离上清液，加入TRIzol试剂提取血清中总RNA，用酶标仪测定RNA的质量和水平。用反转录试剂盒将cDNA反转录为DNA，以U6为内参，DNA为模板，采用RT-PCR法测定血清miR-21、miR-26和miR-141水平，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。血清miR-21、miR-26及miR-141水平以2-△△Ct表示。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 随访

对结肠癌患者术后通过门诊或电话随访，随访开始时间为2013年7月，截止时间为2020年3月，随访终点为患者死亡。

1.5 统计学方法

应用SPSS 23.0软件进行分析，正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料用例(%)表示。采用ROC曲线分析血清miR-21、miR-26、miR-141单项检测及3项联合检测诊断结肠癌的效能。采用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线，预后的影响因素采用Cox比例风险分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的血清miR-21、miR-26、miR-141水平比较

结肠癌组的血清miR-21、miR-26水平均显著高于对照组，血清miR-141水平显著低于对照组(P均<0.001)。见表2。

表2 两组的血清miR-21、miR-26、miR-141水平比较

2.2 血清miR-26水平与结肠癌患者临床病理特征的关系

不同性别、年龄、肿瘤最大直径的结肠癌患者血清miR-26水平的差异均无统计学意义(P均>0.05)，而不同临床分期、肿瘤分化程度、局部浸润深度、淋巴结转移的结肠癌患者血清miR-26水平的差异均有统计学意义(P均<0.05)。结果提示血清miR-26水平与年龄、性别、肿瘤最大直径均无相关性，而与临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移及局部浸润深度均有相关性。见表3。

表3 血清miR-26水平与结肠癌患者临床病理特征的关系

2.3 血清miR-21、miR-26、miR-141单项检测与联合检测的诊断效能比较

血清miR-21、miR-26、miR-141单项检测及3项联合检测诊断结肠癌的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.847(95%CI：0.765～0.929)、0.812(95%CI：0.721～0.903)、0.932(95%CI：0.872～0.991)及0.980(95%CI：0.953～1.000)，敏感度分别为88.9%、82.6%、84.4%和97.8%，特异度分别为71.1%、95.6%、94.8%和95.6%，这提示3项联合检测的诊断效能显著优于单项检测(P<0.05)。见图1。

图1 血清miR-21、miR-26、miR-141单项检测及联合检测诊断结肠癌的ROC曲线 A 血清miR-21检测 B 血清miR-26检测 C 血清miR-141检测 D 3项联合检测

2.4 血清miR-21、miR-26及miR-141与预后的关系

根据ROC曲线的约登指数计算得出最佳截断值。血清miR-21以1.50为界，将患者分为miR-21高表达组(26例)和低表达组(19例)，高表达组的5年总生存率显著低于低表达组(46.15%比78.95%，P<0.05)； miR-26以2.28为界，将患者分为miR-26高表达组(24例)和低表达组(21例)，高表达组的5年总生存率显著低于低表达组(50.00%比71.43%，P<0.05)；miR-141以1.65为界，将患者分为miR-141高表达组(22例)和低表达组(23例)，高表达组的5年总生存率显著高于低表达组(68.18%比43.47%，P<0.05)。见图2。

图2 血清miR-21、miR-26及miR-141与结肠癌患者5年总生存率的关系 A 血清miR-21 B 血清miR-26 C 血清miR-141

2.5 预后影响因素的Cox比例风险分析

将临床分期、肿瘤分化程度、局部浸润深度、淋巴结转移，以及血清miR-21、miR-26、miR-141水平作为自变量进行结肠癌预后影响因素的Cox比例风险分析，结果显示临床分期Ⅲ～Ⅳ期、局部浸润深度T3～T4期、有淋巴结转移，以及血清miR-21、miR-26高表达和miR-141低表达是结肠癌患者预后的独立危险因素。见表4。

表4 结肠癌患者预后的影响因素分析

3 讨论

结肠癌是常见的恶性肿瘤，近年来由于人口老龄化及人们饮食结构的改变，中国结肠癌的发病率呈逐年升高趋势[12]。尽管结肠癌的治疗方法在不断改进，但仍有不少患者出现转移和复发，严重影响了预后。研究显示，早期结肠癌患者术后的5年生存率高达90%，而晚期患者却低于10%[13]。因此，寻找高效的早期诊断标志物对于延长患者的生存时间、提高生存质量具有十分重要的意义。

目前，血清癌胚抗原水平是临床上较为常用的诊断标志物，但其用于结肠癌筛查的敏感度和特异度均较低，故亟需寻找敏感度和特异度均较高的结肠癌早期诊断标志物[14]。miRNA近年来成为分子生物学领域的研究热点，研究表明miRNA在多种恶性肿瘤细胞和组织中表达异常，其可通过调控促癌基因或抑癌基因的表达，参与肿瘤的发生、发展过程，在肿瘤的诊断、治疗及预后预测方面发挥着重要作用[15]。

既往研究表明，miR-26与多种恶性肿瘤关系密切，其通常发挥着促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的作用[11,16-17]。Liu等[18]的研究发现，与正常组织相比，乳腺癌组织中的miR-26表达水平显著升高，且与乳腺癌细胞的增殖和迁移相关。黄昌俊等[19]对46例肝内胆管癌患者的组织标本及不同肝内胆管癌细胞系进行了研究，发现miR-26在肝内胆管癌组织中呈高表达，可通过PTEN/Akt通路促进肿瘤细胞增殖，并且其高表达是影响肝内胆管癌患者整体生存率的独立危险因素。目前miR-26与结肠癌的关系尚不完全清楚，本研究对结肠癌患者的血清miR-26水平进行了研究，发现结肠癌组的血清miR-26水平显著高于对照组，这说明miR-26可能参与了结肠癌的发生、发展。进一步通过ROC曲线分析血清miR-26用于结肠癌诊断的价值，结果发现AUC为0.812、敏感度为82.6%、特异度为95.6%，这说明血清miR-26检测有助于结肠癌筛查。

研究表明，与单基因检测相比，多基因联合检测的阳性率、敏感度及特异度均更高。余海婷[20]的研究发现，与健康对照组相比，结肠癌患者的血清miR-21表达显著升高，ROC曲线分析结果显示其诊断结肠癌的AUC、敏感度及特异度分别为0.82、75.6%、81.4%。王亚南等[21]的研究发现，血清miR-141诊断结肠癌的AUC为0.72。本研究中ROC曲线分析显示，血清miR-21、miR-26及miR-141联合检测诊断结肠癌的AUC、敏感度和特异度均优于单项检测。

为进一步探讨miR-26在结肠癌发生、发展中的作用，本研究分析了血清miR-26水平与结肠癌患者临床病理特征的关系，结果显示miR-26与结肠癌淋巴结转移有关，这说明血清中miR-26高表达可能与肿瘤细胞的侵袭和转移有关，但具体调控机制有待进行更深入的体内外细胞研究。此外，本研究发现血清miR-26水平升高还与结肠癌患者的临床分期、肿瘤分化程度、局部浸润深度及5年总生存率有关，这说明miR-26可以作为预测结肠癌患者预后的独立危险因素。本研究是单中心研究且样本量较少，因此结果可能存在一定的局限性，今后将深入开展多中心大样本量的相关研究。

综上所述，血清miR-26水平与结肠癌的发生、发展密切相关，其可作为结肠癌早期诊断及预后预测的生物标志物，其与血清miR-21、miR-141联合检测的诊断效能优于单项检测。