NDV感染促进hnRNPA1进入细胞质帮助病毒增殖

姜维雨，丁 铲，廖 瑛

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

新城疫是危害养禽业的一类动物疫病，由感染新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为症状，具有很高的发病率和死亡率。NDV基因组RNA长度为15 186 bp，依次编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphate protein，P）、基质蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（large protein，L）。P基因还通过RNA编码两个非结构蛋白：V和W。NP的氨基端包裹病毒基因组RNA，以避免其被降解[1]；其羧基端则发挥RNA聚合酶的作用[2]。M蛋白为疏水蛋白，没有跨膜区，位于囊膜与核衣壳之间。在病毒复制早期，M蛋白定位于细胞核内；在病毒复制晚期，M蛋白出核到达细胞膜，与F蛋白和HN蛋白相互作用，并与核衣壳结合，最终完成病毒粒子组装和出芽。另有研究表明，M蛋白负责维持病毒核衣壳的球形形状[3]。

核不均一核糖体蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）有A和B两个亚家族，主要分布在细胞核内，与细胞核中的前体mRNA相互作用，影响前体mRNA的加工以及mRNA的代谢和转运[4]。该家族的典型成员hnRNPA1广泛参与转录调控和mRNA的加工[5]，并跟神经退行性疾病相关[6]。hnRNPA1通过以下方式发挥功能：（1）转录调节：在转录过程中，hnRNPA1结合到双链DNA上的特定靶序列，形成蛋白-蛋白复合物，抑制转录[7]；（2）mRNA拼接控制：真核生物的蛋白质组多样性在很大程度上取决于前体mRNA选择性拼接的程度，而hnRNPA1能影响剪接体对前体mRNA选择性剪接位点的选择；（3）应激颗粒的组装：应激颗粒是细胞压力应激时在细胞质中形成的蛋白和RNA聚集颗粒[8]。hnRNPA1因其RNA结合特性以及与蛋白质相互作用而参与应激颗粒的组装[9]；（4）MicroRNA的加工；（5）端粒延长。

已有研究结果表明，hnRNPA1促进非典型肺炎冠状病毒[10]、鼠肝炎病毒[11]、猪流行性腹泻病毒[12]、肠道病毒[13]，以及辛德毕斯病毒[14]的复制。然而，hnRNPA1对副粘病毒复制的影响尚未有报道。本研究发现，NDV感染可促进hnRNPA1从细胞核进入细胞质，并与NDV核衣壳蛋白NP发生共定位和相互作用。考虑到hnRNPA1和NP均有RNA结合能力，我们推测hnRNP A1通过NP蛋白结合到病毒RNA基因组，参与了病毒基因组的复制和转录过程。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Flag-HRP抗体及HA-HRP抗体购自MBL公司；anti-hnRNPA1抗体购自CST公司；RIPA购自碧云天生物技术有限公司；TRIzol裂解液购自Thermo Fisher公司；反转录酶MLV购自Promega公司；Anti-Flag抗体亲和凝胶购自Bimake公司。

1.2 细胞与病毒 HeLa细胞及293T细胞购自ATCC，并由本实验室保存。培养于含10% FBS（Gibco）、双抗（细胞培养用青霉素-链霉素）的DMEM，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。NDV标准强毒株Herts/33由中国兽药监察所提供，本实验室保存。

1.3 NDV感染 以5×105个HeLa细胞铺6孔板，待细胞长至70%～80%时用PBS洗细胞3次，无血清DMEM稀释NDV，以1 MOI（multiplicity of infection）感染细胞，置于37℃、5%CO2培养箱吸附1 h。PBS清洗细胞3次，去除未吸附的病毒后，更换为2% FBS DMEM培养基继续培养。

1.4 间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA） 以4%多聚甲醛室温固定细胞15 min；0.5% TritonX-100室温透化细胞15 min；以3% BSA 37℃条件下封闭1 h；37℃孵育anti-NDV NP鼠源单克隆抗体2 h，37℃孵育Alexa Fluor 488 nm goat anti-Mouse IgG荧光二抗1 h；37℃孵育anti-hnRNPA1兔源抗体2 h；37℃孵育Alexa Fluor 594 nm goat anti-Rabbit IgG荧光二抗1 h；室温孵育DAPI染色液10 min。在载玻片中央滴一滴抗荧光猝灭封片剂，取出细胞爬片倒扣于封片剂上，室温避光风干，使用蔡司激光共聚焦显微镜观察。

1.5 质粒转染 以每孔5×105个HeLa细胞铺板。待细胞长至60%～80%时，使用Fugene HD转染试剂进行质粒转染。

1.6 免疫共沉淀 以8×107个293T细胞铺100 mm培养皿。12 h后，分别转染质粒Flag-M和HA-hnRNPA1、Flag-NP和HA-hnRNPA1、Flag-P和HA-hnRNPA1、pCMV-Flag载体和HA-hnRNPA1各3 μg。转染24 h后以RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清液，加入Anti-Flag亲和凝胶中，4℃旋转孵育4 h。以2400 ×g离心10 s，弃上清液。利用RIPA裂解液洗3～5次，彻底弃去上清液，加入50 μL 2×SDS上样缓冲液，100℃金属浴10 min。样品用于后续SDS-PAGE和Western blot分析。

1.7 siRNA设计及siRNA干扰 根据hnRNPA1（GenBank登录号：XM_005268826）基因序列，设计siRNA（序列为5'-AGCAAGAGATG GCTAGTGC-3'），由上海吉玛制药技术有限公司合成，同时合成一段无义对照siNC（序列为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）。

待细胞长至40%时，用Lipofectamine 2000进行siRNA转染。36 h后，以1 MOI的NDV感染。感染后12 h收取细胞样品，Western blot检测干扰效果和病毒蛋白的表达，或荧光定量RT-PCR检测病毒的RNA水平。

1.8 SDS-PAGE及Western blot鉴定 将蛋白样品室温离心10 min后取10 μL上样，进行SDS-PAGE电泳，并转印至NC膜上。5%脱脂乳室温封闭NC膜1 h后，4℃孵育一抗过夜，PBST洗3次，再室温孵育NC膜和HRP标记的二抗1 h，PBST洗3次。然后将NC膜置于发光液中孵育2 min，在化学图像分析仪中显影并保存图像。

1.9 细胞RNA抽提、反转录及荧光定量PCR 6孔板每孔加1 mL TRIzol细胞裂解液抽提RNA，将细胞裂解液移入无RNA酶离心管中，加入200 mL氯仿，剧烈震荡15 s。静置5 min后，13 700 ×g、4℃离心15 min，小心吸取上清液至新的无RNA酶离心管。加入200 mL异丙醇，-20℃沉淀2 h。13 700 ×g、4℃离心15 min，弃上清液，加入75%乙醇，13 700 ×g、4℃离心10 min。彻底弃去上清液，室温风干至乙醇完全挥发。加入30 μL DEPC水，65℃孵育15 min溶解RNA，使用分光光度计测量RNA浓度。

取3 μg RNA进行反转录，获得cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green染料法进行荧光定量RT-PCR，引物如表1所示。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共35个循环。采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对含量，以β-actin做为内参基因。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Primers of RT-qPCR

2 结果

2.1 NDV感染导致hnRNPA1出核 以1 MOI NDV标准强毒株Herts/33感染HeLa细胞，Mock感染为对照组。利用NDV NP鼠源抗体及hnRNPA1兔源抗体进行免疫荧光实验，检测病毒蛋白NP和hnRNPA1的亚细胞定位。结果可知，在Mock感染的细胞中，hnRNPA1聚集于细胞核；NDV感染16 h，少量的hnRNPA1蛋白出核进入细胞质，并与病毒核衣壳蛋白NP共定位（图1）。以上结果表明，NDV感染促进hnRNPA1出核，迁移至病毒核衣壳蛋白NP所在位置。

图1 NDV病毒感染诱导hnRNPA1蛋白出核，与病毒蛋白NP共定位Fig.1 NDV infection induced hnRNPA1 nuclear export and co-localized with viral protein NP

2.2 NDV NP和M蛋白与hnRNPA1存在相互作用 在非典型冠状病毒、鼠肝炎病毒及猪流行性腹泻病毒感染过程中，感染引起hnRNPA1出核，并与病毒核衣壳蛋白NP相互作用，影响病毒基因组RNA的复制。通过免疫荧光实验发现，hnRNPA1出核后，与NDV核衣壳蛋白NP共定位。NP结合病毒负链基因组RNA，并与P蛋白、L蛋白一起，形成病毒复制小体[15]。因此，我们推测hnRNPA1出核后，迁移至病毒复制小体，参与病毒的复制。为了证实以上推测，我们在293T细胞中共表达Flag-NP和HA-hnRNPA1、Flag-P和HA-hnRNPA1、Flag-M蛋白和HA-hnRNPA1，或者pCMV-Flag载体和HA-hnRNPA1。24 h后裂解细胞，以Anti-Flag亲和凝胶进行免疫共沉淀，再利用HA抗体进行Western blot，检测HA-hnRNPA1是否跟Flag标签的病毒蛋白共沉淀。结果可知，在全细胞裂解液中，各个带Flag标签的病毒蛋白和带HA标签的hnRNPA1均成功表达；在免疫共沉淀的样品中，HA-hnRNPA1被Flag-NP和Flag-M共沉淀，但不能被Flag-P或者pCMV-Flag载体共沉淀，揭示hnRNPA1跟NP和M蛋白相互作用，跟P蛋白不存在相互作用（图2）。

图2 NDV NP和M蛋白与hnRNPA1相互作用Fig.2 NDV NP and M interact with hnRNPA1

2.3 干扰hnRNPA1的表达不利于NDV的复制 以上实验结果说明：NDV感染导致hnRNPA1出核，且hnRNPA1迁移至病毒复制小体，与病毒的NP、M蛋白相互作用。但hnRNPA1在病毒的感染过程中，发挥了促进病毒增殖的作用还是抗病毒作用呢？我们在HeLa细胞中，转染sihnRNPA1干扰hnRNPA1的表达，以转染non-target control siRNA（NC）作为阴性对照。转染siRNA 36 h之后，以1 MOI剂量的NDV感染细胞，12 h后收取细胞样品，以Western blot检测hnRNPA1的干扰效果和病毒蛋白的表达。结果可知，与NC对照组相比较，sihnRNPA1成功地干扰了hnRNPA1的表达，并且，病毒蛋白NP的表达略有降低（图3A）。进一步检测NDV NP mRNA发现，相较于NC组，干扰hnRNPA1的实验组NDV的mRNA水平显著降低（图3B）。以上结果揭示hnRNPA1对病毒复制起着促进作用。

图3 siRNA干扰hnRNPA1的表达不利于NDV的复制Fig.3 siRNA knock down of hnRNPA1 does not support NDV replication

2.4 外源表达hnRNPA1有利于NDV复制 在HeLa细胞转染HA-hnRNPA1质粒时，以另一组细胞转染pCMV-HA载体作为阴性对照。转染24 h后，以1 MOI NDV感染，12 h收取细胞样品，Western blot检测HA-hnRNPA1和病毒蛋白的表达。结果可知，HA-hnRNPA1成功表达；与pCMV-HA转染组相比较，HA-hnRNPA1显著促进了病毒蛋白NP的表达。进一步检测病毒mRNA发现，相较于pCMV-HA对照组，HA-hnRNPA1促进病毒mRNA的复制水平（图4B）。本实验进一步证实了hnRNPA1对NDV复制增殖的促进作用。

图4 外源表达hnRNPA1促进NDV复制Fig.4 Overexpression of hnRNPA1 enhances NDV replication

3 讨论

在本研究中，我们发现NDV感染导致hnRNPA1出核，与病毒核衣壳蛋白NP共定位，并能结合NP，说明hnRNPA1可能迁移到病毒复制小体，参与病毒的复制。出乎意料的是，病毒M蛋白也与hnRNPA1有相互作用。有报道表明，NDV M蛋白在感染早期进入细胞核，抑制宿主细胞RNA转录，有助于病毒RNA的复制和转录[16]。我们推测M蛋白进入细胞核后，促进hnRNPA1出核进入细胞质，迁移至病毒复制小体，促进病毒基因组RNA的合成及mRNA的转录。然而，hnRNPA1的出核机制尚不清楚，还需要进一步研究。

进一步实验证实，siRNA干扰hnRNPA1的表达，病毒RNA复制和蛋白表达有所下降，外源表达hnRNPA1，病毒RNA复制和蛋白表达均有所升高，说明hnRNPA1确实有助于病毒的复制增殖。虽然干扰或过表达hnRNPA1对病毒的复制有影响，但幅度不大。造成这一结果的原因，可能是由于转染效率的缘故：不是所有的细胞都能有效地转染hnRNPA1质粒或者siRNA，这一部分未转染的细胞，干扰了实验结果；另一个可能性是hnRNPA1对病毒复制起到辅助作用，但不是必需的。

以往关于hnRNPA1参与病毒复制的研究，多集中在冠状病毒、禽流感、甲病毒及肠道病毒[13]。在肠道病毒感染过程中，hnRNPA1通过改变病毒IRES（internal ribosome entry sites，IRES）的结构以促进病毒复制；在辛德毕斯病毒感染过程中，hnRNPA1通过促进病毒正链RNA和负链RNA的合成，帮助病毒复制；在冠状病毒科的非典型肺炎冠状病毒、鼠肝炎病毒及猪流行性腹泻病毒感染过程中，hnRNPA1与核衣壳蛋白N相互作用，促进病毒基因组复制。以上研究说明，hnRNPA1对不同病毒复制的影响机制有所区别。在本研究中，我们发现hnRNPA1与NDV核衣壳蛋白NP相互作用，促进病毒复制增殖，其具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究首次证实了hnRNPA1参与副粘病毒的复制。鉴于hnRNPA1结合RNA的特性，推测此蛋白家族可能广泛性地参与RNA病毒的复制。