汉赛巴尔通体效应蛋白BepE与血管内皮细胞迁移的相关性研究

蔡雨豪，王 蒙，王春艳，丁田耘，张浩然，袁聪俐

（上海交通大学农业与生物学院，上海 200240）

巴尔通体（Bartonlla）是一种胞内寄生、兼性厌氧的革兰氏阴性菌[1]。汉赛巴尔通体（Bartonella henselae，Bhe）以猫为天然宿主，除了以节肢动物为媒介进行传播外，还可通过携带该病原的猫抓伤或者咬伤感染人，是已知的巴尔通体中致病谱最广的病原体[2-3]。具有正常免疫功能的人感染汉赛巴尔通体后主要表现为自限性淋巴结肿大，伴有发热等症状，还可能引发慢性菌血症、感染性心内膜炎、骨髓炎等疾病[4-5]。而有免疫缺陷的患者，感染汉赛巴尔通体会导致杆菌样血管瘤，一般表现为皮肤表面长出数个至数十个分散的丘疹或结节[6]。这是由汉赛巴尔通体感染后在皮肤上产生的血管增生性损伤引起的[6-7]。另外，免疫缺陷的患者还可能发生杆菌样紫癜，通常表现为腹痛、呕吐厌食，伴随发热等症状[7-8]。

研究表明，巴尔通体Ⅳ型分泌系统分泌的效应蛋白（Bartonellaeffector proteins，Beps）是典型的多结构域蛋白，主要由有酶活性的cAMP炎症诱导区域（filamentation induced by cAMP，FIC）和参与分泌的巴尔通体胞内呈递区域（bep intracellular delivery，BID）结构域组成[9-10]。已有研究发现，效应蛋白BepE在汉赛巴尔通体的体内扩散转移及导致杆菌样血管瘤的过程中行使重要功能，其BID结构域可以挟持树突状细胞作为运输工具，促使巴尔通体菌定殖于血液系统[11-12]。通过细胞感染实验证实BepE具有促进树突状细胞迁移的功能，同时BepE可以抑制由BepC等其他效应蛋白导致的细胞碎片化现象（cell fragmentation）[13-14]。血管内皮细胞是汉赛巴尔通体感染的主要靶细胞之一[15]，BepE在汉赛巴尔通体感染血管内皮细胞过程中是否也具有促进细胞迁移的功能尚未报道。

本研究采用同源重组基因敲除技术构建BepE基因敲除及回补菌株，通过细胞划痕实验研究BepE对血管内皮细胞迁移的影响，为后续研究BepE在汉赛巴尔通体感染HUVEC过程中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒与细胞 汉赛巴尔通体ATCC 49882（ATCC，美国）、pJM05质粒与pANT4质粒由加利福尼亚大学旧金山分校惠赠；HUVEC人脐静脉内皮细胞购自澳赛尔斯生物技术有限公司；DH5α与S17-1感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂购自OXOID公司；无菌脱纤维绵羊全血购自杭州新锐生物工程有限公司；Medium 199/EBSS培养基、内皮细胞完全培养基购自HyClone公司；Fast pfu fly DNA Polymerase高保真酶购自北京全式金生物技术有限公司；SalⅠ、BamHⅠ、PstⅠ等限制性核酸内切酶与T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；2×Hieff®Robust PCR Master Mix (With Dye)、Hieff Clone™Plus Multi One Step Cloning Kit购自上海翊圣生物科技有限公司；SurePAGE™蛋白预制胶、20×MOPS电泳缓冲液购自金斯瑞生物科技有限公司；卡那霉素、萘啶酸、头孢唑啉等抗生素购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 汉赛巴尔通体BepE基因的敲除

1.3.1 BepE敲除质粒pJM05-ΔBepE的构建 根据Bartonellahenselaestrain Houston-1（GenBank登录号：BX897699.1）及质粒pJM05的序列设计P1-F/P1-R、P2-F/P2-R两对引物，扩增汉赛巴尔通体BepE上、下游同源片段P1与P2（612 bp、579 bp），再设计缺失片段外引物BheⅠ-F/BheⅠ-R及缺失片段内引物BheⅡ-F/BheⅡ-R鉴定BepE缺失突变型Bhe-ΔBepE（2613 bp、1100 bp）。引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

以汉赛巴尔通体ATCC 49882株为模板，用高保真酶扩增同源片段P1与P2，PCR扩增结束后进行核酸凝胶电泳，对目的条带进行胶回收。用BamHⅠ、SalⅠ限制性核酸内切酶对PJM05质粒进行双酶切，并通过核酸凝胶电泳对目的条带进行胶回收。用Hieff Clone™Plus Multi One Step Cloning Kit对同源片段P1、P2与酶切后的pJM05质粒进行一步法连接。

将连接产物转化DH5α感受态，并涂布于Kan+抗性平板上，次日挑取单菌落进行PCR鉴定并测序，结果正确的即为敲除质粒pJM05-ΔBepE。

1.3.2 单交换菌株的制备 将敲除质粒pJM05-ΔBepE转化S17-1感受态细胞，并涂布于Kan+抗性平板上。次日挑取单菌落摇菌14～16 h。将菌液以1∶100稀释，复摇2～3 h，至OD600达到0.6～0.8。取1 mL复摇后的S17-pJM05-ΔBepE菌液，6000×g离心3 min，弃上清液，用M199S培养基洗3次，用700 μL的M199S培养基重悬菌体。取重悬后的菌液进行1∶1、1∶10、1∶100稀释，各取500 μL涂布至生长4 d的三代Bhe平板上，轻转铺匀平板，正置于35℃培养箱孵育5～6 h。

刮取孵育好的菌体至1 mL的M199S培养基中，混匀后做1∶10、1∶100、1∶1000稀释，将不同浓度菌液涂布至三抗血平板上（卡那霉素、萘啶酸与头孢唑林抗性），倒置于35℃的CO2培养箱中培养。

挑取三抗平板上的单菌落划线至Kan+血平板上，35℃条件下培养4～5 d，得到pJM05-ΔBepE整合到Bhe基因组上的汉赛巴尔通体单交换菌株[15]。

1.3.3 SacB蔗糖筛选及PCR鉴定 将Bhe单交换菌刮到1 mL的M199S培养基中，混匀后做1∶10、1∶100、1∶1000稀释，分别涂布到10%蔗糖血平板上。SacB基因水解蔗糖产生大量果聚糖，对细菌产生毒性，通过蔗糖压力筛选能使pJM05发生二次重组从而从基因组中置换下来，导致Bhe发生BepE缺失突变，平板上长出的即为Bhe野生型菌或BepE缺失突变菌。

设计缺失片段外引物BheⅠ-F/BheⅠ-R及缺失片段内引物BheⅡ-F/BheⅡ-R，用于鉴定SacB蔗糖筛选后的野生型和突变型菌株，引物序列如表1所示。在血平板上刮取少量菌作模板，进行PCR鉴定，根据PCR结果鉴定出BepE缺失突变型Bhe-ΔBepE。

1.4 Bhe-BepE回补表达菌的构建及表达鉴定

1.4.1 BepE回补表达质粒pANT4-BepE-Flag的构建设计并合成BepE-F/BepE-R引物，扩增汉赛巴尔通体BepE与Flag标签的融合片段（该片段由本实验合成并保存），引物序列如表1所示。

用BamHⅠ/PstⅠ限制性核酸内切酶分别对pANT4质粒与BepE-Flag片段进行双酶切，通过核酸电泳回收质粒与片段。使用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化DH5α感受态，涂布于Kan+抗性LB平板上。次日挑取单菌落进行菌落PCR鉴定并测序，结果正确的即为回补表达质粒pANT4-BepEFlag。

1.4.2 pANT4-BepE-Flag回补Bhe-ΔBepE 将回补表达质粒pANT4-BepE-Flag转化S17-1感受态，并与BepE缺失突变型菌进行接合转移，方法同1.3.2。

待三抗血平板上长出单菌落后，挑取单菌落划线到Kan+血平板上，35℃培养4～5 d，得到BepE的回补表达菌株Bhe-pBepE。

1.4.3 回补表达菌株Bhe-pBepE的表达鉴定 刮取少量Bhe-pBepE菌到1×SDS PAGE蛋白上样缓冲液中，混匀后100℃水浴加热12 min，进行Western blot鉴定。取10 μL蛋白样品，140 V电压下电泳60 min。将PVDF膜用甲醇激活1 min，110 V电压下转膜60 min。转膜后的PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1 h。再用抗Flag标签的小鼠单克隆抗体室温孵育2 h，TBST洗5次，每次5 min。用羊抗鼠IgG(H+L)二抗室温孵育60 min，TBST清洗5次，每次5 min，加入ECL超敏发光显色液进行发光显色并拍照记录。

1.5 细胞划痕实验 在24孔板上铺2×104个HUVEC细胞，待细胞密度达到60%～70%时，弃去细胞培养基，用PBS洗3遍，加入2.5%FBS的内皮细胞基础培养基。分别用Bhe-ΔBepE、Bhe-pBepE及Bhe野生型感染HUVEC（MOI=500），以只加内皮细胞基础培养基的细胞为阴性对照。

感染24 h后，用无菌的移液枪枪头在24孔板上划一道竖直的划痕，尽量保持划痕宽度一致，用倒置显微镜及活细胞工作站定时、定点拍摄同一位置的划痕区域（每组选择3个位点）。利用ImageJ软件处理图片，分别计算各个位点0 h、6 h、12 h与18 h的划痕区域面积，以每个位点减少的划痕区域面积与0 h的划痕面积的比值为该位点的细胞迁移率，从而用GraphPad Prism8软件比较各组的细胞迁移能力。

1.6 Transwell小室实验 用慢病毒分别包被Bhe-BepE-Flag基因与空白Flag标签（由吉满生物科技有限公司合成），感染HUVECs。用明胶包被Transwell小室（直径6.5 mm，PC膜孔径8.0 μm），取300 μL感染48 h的HUVECs加入小室上层，下层加700 μL细胞培养基。6 h后擦去上层细胞，用hoechst染料对下层细胞进行染色并计数，以下层细胞数量多少评价HUVECs迁移能力。

2 结果

2.1 敲除质粒与回补质粒的鉴定 对重组pJM05-ΔBepE与pANT4-BepE-Flag质粒进行PCR鉴定，结果显示，在1200 bp与1600 bp左右处有目的条带，分别与ΔBepE、BepE-Flag基因大小相符。

2.2Bhe-ΔBepE的缺失鉴定与Bhe-pBepE的表达鉴定通过SacB蔗糖压力筛选，pJM05质粒从Bhe基因组上掉落，得到回复野生型和缺失突变型两种菌株。用缺失片段外引物BheⅠ-F/BheⅠ-R及缺失片段内引物BheⅡ-F/BheⅡ-R对两种菌进行PCR鉴定。BepE框内缺失片段大小为1167 bp，所以利用引物BheⅠ-F/BheⅠ-R扩增Bhe野生型得到片段大小为2613 bp，而缺失突变型Bhe-ΔBepE的扩增片段大小为1446 bp。利用缺失片段内引物BheⅡ-F/BheⅡ-R扩增野生型Bhe的片段大小为1100 bp，而缺失突变体扩增结果应该为阴性。如图2A、2B所示，1～8号为BepE缺失突变株，9号为阴性对照，10号为Bhe野生型对照。

由于BepE的回补表达株Bhe-pBepE能够通过其OriV复制起始位点与Ptac强启动子持续表达带Flag标签的BepE蛋白。因此用抗Flag标签抗体进行Western blot鉴定，在68 kDa处出现清晰可见的条带，及数条BepE蛋白降解条带，而对照组Bhe-ΔBepE因不含带Flag标签的BepE而未显示条带（如图2c所示）。该结果说明BepE成功回补表达。

图1 重组质粒的鉴定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

图2 Bhe-ΔBepE与Bhe-pBepE的鉴定Fig.2 Identification of Bhe-ΔBepE and Bhe-pBepE

2.3 细胞划痕实验结果与分析 分别用Bhe-ΔBepE、Bhe-pBepE及Bhe野生型感染HUVECs，以只加内皮细胞基础培养基的细胞为阴性对照。细胞划痕实验的结果如图3所示。

图3 细胞划痕实验结果Fig.3 Experiment results of wound healing assay

细胞划痕实验结果显示，HUVEC细胞从划痕边界不断向中间迁移，通过（初始划痕面积-某一时刻的面积）/初始面积计算该时刻细胞的迁移率。利用GraphPad Prism8软件对4组细胞0、6、12和18 h的迁移率进行比较，结果显示差异并不显著（P＞0.05）。划痕实验结果说明，BepE无法促进巴尔通体感染HUVEC的迁移能力。

2.4 Transwell小室实验结果 分别用包被Bhe-BepEFlag基因与空白Flag标签的慢病毒感染HUVECs并进行Transwell小室实验，显微镜下各取12个视野计算下层细胞数量。如图4所示，两组中迁移入下室的细胞数量无显著差异（P＞0.05）。说明在细胞内过表达Bhe-BepE也无法促进HUVEC的迁移能力。

图4 Transwell小室实验结果Fig.4 Experiment results of Transwell assay

3 讨论

有文献报道称，巴尔通体在皮下感染后入侵树突状细胞，其分泌的效应蛋白BepE一定程度上能促进树突状细胞迁移。而血管内皮细胞是巴尔通体感染的主要靶细胞，通过调控血管内皮细胞生理功能导致杆菌样血管瘤形成[11-12]。鉴于血管内皮细胞迁移与血管瘤生成的显著相关性，本研究进一步探究汉赛巴尔通体的BepE是否也有促进血管内皮细胞迁移的作用。本研究细胞划痕实验结果显示，Bhe-ΔBepE、Bhe-pBepE及Bhe野生型三种菌分别感染后，HUVECs的迁移能力与对照组细胞相比并无显著差异，提示BepE并不具有对血管内皮细胞的促迁移能力。但是，研究尚未对巴尔通体感染内皮细胞后BepE的细胞内转运能力进行鉴定，无法排除本研究所用的巴尔通体菌株在细胞内的适应性不强，无法抑制细胞内溶酶体杀伤作用，从而阻碍了BepE细胞内转运。因此我们用包被Bhe-BepE的慢病毒感染HUVECs，通过Transwell小室实验直接研究BepE的促血管内皮细胞迁移能力研究。结果显示，过表达Bhe-BepE无法促进HUVECs的迁移。综上结果说明，巴尔通体BepE自身无法促进血管内皮细胞迁移。但是我们通过其他实验发现巴尔通体BepE能够有效促进细胞黏着斑的去组装，因此还需要通过进一步的实验以阐明BepE是否需要与其他效应蛋白合作产生协同效应，利用其他效应蛋白促细胞收缩能力及其自身的促黏着斑去组装能力，从而促进细胞迁移。