响应面法优化桑叶黄酮的提取工艺及提取物抗氧化性能的研究
2021-11-04张心壮
■张心壮 刘 宇 芒 来
（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室，农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站，内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古呼和浩特 010018）
畜禽健康是维持畜牧业持续平稳发展的必要保证，动物体内自由基稳态失衡是氧化应激-炎症反应-免疫功能失衡，导致畜禽发病、降低生产性能的根本原因。氧化应激会导致细胞损伤进而衰老并逐步凋亡，激活促炎因子释放引起炎症反应，导致机体蛋白质、核酸、脂质等生物大分子的物质结构以及生理功能发生变化，引起动物机体代谢发生异常、生长发育受到抑制以及抗病能力降低，进而降低畜禽生产性能和畜产品品质[1]。生产中可以通过营养调控手段，如在畜禽饲粮中添加抗氧化剂等，改善氧化平衡状态，缓解氧化应激损伤[2]。
桑叶自古至今作为一种中草药，富含黄酮、生物碱、多糖等天然活性成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等药理作用[3]。大量研究表明桑叶黄酮对氧化剂和自由基具有较强的清除能力[4-6]。Zhang 等[7]前期的研究结果表明桑叶提取物能够通过提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量提高牛肉的抗氧化性能，延长货架期，这可能与桑叶黄酮有着密不可分的关系。桑叶黄酮是经过一系列工艺从桑叶中提取的具有生物学活性的复合物[8]。但是对桑叶黄酮的提取工艺，以及桑叶提取物的抗氧化活性还缺乏系统的研究。响应面法（RSM）是一种统计方法，它使用来自适当试验设计的定量数据来确定并同时求解多变量方程，广泛应用于植物活性物质提取工艺的优化[9]。本试验以桑叶为研究对象，通过单因素试验分析超声波辅助、提取时间、提取温度、料液比以及乙醇浓度对桑叶黄酮提取率的影响，利用响应面法优化桑叶黄酮提取工艺，并对其抗氧化性能进行研究，旨在为桑叶黄酮作为天然抗氧化剂在畜禽生产中缓解氧化应激应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
试验试剂NaOH、NaNO2、Al（NO3）3、无水乙醇均为分析纯，购置于国药集团化学试剂北京有限公司；DPPH、芦丁均为Sigma 试剂标准品。电子天平（ME-204，瑞士METTLER TOLEDO 有限公司）、超声波仪器、三孔三温数显恒温水浴锅（DK-8D，常州申光仪器有限公司）、Epoch 全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 样品处理
采集新鲜桑叶，65 ℃烘干制备桑叶粉，过80 目筛，干燥贮存备用。
1.2.2 单因素对桑叶黄酮提取率的影响
①超声波辅助提取：准确5 g（精确到0.000 1 g）桑叶粉，按照料液比1∶30 (g/mL)、乙醇浓度60%、60 ℃温度条件下分别进行15、20、25 min的恒温提取和超声波辅助提取，提取后分别取200 μL提取液，测定黄酮提取率。
②乙醇浓度：准确称取5 g（精确到0.000 1 g）桑叶粉，按照提取温度60 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度40%、50%、60%、70%和80%，超声波辅助提取20 min，分别取200 μL提取液，测定黄酮提取率。
③提取温度：准确称取5 g（精确到0.000 1 g）桑叶粉，按照乙醇浓度60%、料液比1∶30（g/mL）、提取温度40、50、60、70、80 ℃，超声波辅助提取20 min，分别取200 μL提取液，测定黄酮提取率。
④提取时间：准确称取5 g（精确到0.000 1 g）桑叶粉，按照乙醇浓度60%、料液比1∶30（g/mL）、提取温度60 ℃、超声波辅助提取10、15、20、25、30 min，分别取200 μL提取液，测定黄酮提取率。
⑤料液比：准确称取5 g（精确到0.000 1 g）桑叶粉，按照乙醇浓度60%、提取温度60 ℃、料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g/mL），超声波辅助提取20 min，分别取200 μL提取液，测定黄酮提取率。
1.2.3 响应面优化桑叶提取物的因素与水平
使用Design-Expert 7.1.3 设计响应面试验方案，根据单因素试验选择桑叶黄酮提取率较高的4 个单因素对应的参数作为优化桑叶黄酮提取工艺的水平零点如表1所示，分别为乙醇浓度60%、温度60 ℃、提取时间20 min、料液比1∶30（g/mL），系统生成29 个试验处理。
表1 桑叶提取试验的因素和水平
1.2.4 标准曲线的绘制
参考付丽红等[10]方法建立黄酮提取率测试的芦丁标准曲线：准确吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL 芦丁标准品原液置于1.5 mL 的离心管中，再分别补加0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 mL的95%乙醇溶液，封盖混匀，得到不同浓度的芦丁标准溶液。分别吸取200 μL 放在新的离心管中，加入20% NaNO2溶液30 μL，充分混匀后反应3 min，加入40% Al（NO3）3溶液40 μL，充分混匀后反应3 min，最后加入20% NaOH溶液100 μL，充分混匀后反应10 min。每个样品各取200 μL，加入到96 孔板上，记好每个孔中芦丁原液的浓度，放入全自动酶标仪中，设置波长为510 nm，测得吸光度值。得到线性回归方程为y=2.476x-0.004，R2=0.988。
1.2.5 黄酮提取率的检测
准确吸取200 μL 提取液于1.5 mL 刻度离心管中，按照标准曲线的步骤测定样品中黄酮浓度，并根据以下公式计算桑叶黄酮提取率。
得率（mg/g）=C×N×V/M
式中：C——测定液总黄酮提取率（mg/mL）；
N——稀释倍数；
V——样品体积（mL）；
M——原料质量（g）。
1.2.6 桑叶提取物DPPH自由基清除活性的测定
参考Pereira等[11]的方法进行改进，按照中心组合试验设计向29支离心管加入2 mL不同提取条件的桑叶提取物，然后分别加入浓度3×10-4mol/L DPPH 溶液2.0 mL，混合摇匀，反应30 min后在517 nm处测定其吸光度A1。以2.0 mL 无水乙醇代替DPPH 的吸光度为A2，以2.0 mL的纯化水代替样品溶液的吸光度为A0，以无水乙醇作为参比液。DPPH 自由基清除活性可用以下公式表示。
SA（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100
1.3 统计方法
所有试验均重复3 次，试验结果使用SAS 9.2 统计软件中GLM模型对桑叶黄酮提取率进行单因素方差分析，Duncan’s 法多重比较。Design-Expert 7.1.3建立桑叶黄酮提取率和DPPH 自由基清除活性的响应面模型，并分析其响应面结果。P<0.05表示差异显著，0.05
2 结果与讨论
2.1 单因素试验对桑叶提取物黄酮提取率的影响(见图1～图5)
图1 超声波辅助与恒温提取桑叶黄酮提取率的比较
图2 乙醇浓度对桑叶提取物黄酮提取率的影响
图3 提取温度对桑叶提取物黄酮提取率的影响
图4 提取时间对桑叶提取物黄酮提取率的影响
图5 料液比对桑叶提取物黄酮提取率的影响
由图1 可知，随着提取时间的延长，超声波辅助提取与恒温提取所得黄酮提取率呈现先上升后降低的趋势，且都在20 min 的时间点达到最高值，且超声波辅助提取所得提取物的黄酮提取率高于恒温提取所得黄酮提取率。
由图2可知，随乙醇浓度的升高，黄酮提取率呈现先升高后降低的趋势，在乙醇浓度为60%时，黄酮提取率达到最高。谭春远等[12]研究同样发现特纳草黄酮的提取率随着乙醇浓度升高出现先增加后降低的趋势。
由图3 可知，随提取温度的升高，黄酮提取率呈现先升高后降低的趋势，在提取温度为60 ℃时，黄酮提取率达到最高为3.02%。温度升高，分子的运动速率加快，有利于黄酮的溶解与溶出，可以增加提取率；但当温度继续升高，会降低溶剂密度，从而降低产率，而且过高的温度可能会导致部分黄酮类化合物降解，使得提取率降低[13]。
由图4 可知，随提取时间的延长，黄酮提取率呈现先升高后降低的趋势，在提取时间为20 min 时，黄酮提取率达到最高为2.91%。
由图5 可知，随料液比的降低，黄酮提取率呈现先升高后降低的趋势，在料液比为1∶30（g/mL）时，黄酮提取率达到最高为2.82%。可能是由于在较高的料液比下，萃取过程中溶剂很快达到饱和，较低的料液比条件下，进入细胞的溶剂较多，渗透到溶剂中的化合物较多，黄酮提取更加彻底，但是当料液比太低的时候，可能会削弱超声波的辅助作用，影响总黄酮的溶出，反而使得总黄酮提取率下降。黄琼等[14]在洛神花总黄酮提取工艺中的研究同样发现随着液固比的升高，黄酮提取率出现先升高后降低的变化。
2.2 响应面法优化桑叶提取物黄酮提取工艺（见表2）
由表2 可知，中心试验设计共进行29 组试验，为减少误差零点共测定5 次，其中黄酮提取率最低为1.63%，最高为3.42%。
表2 桑叶提取试验设计与试验结果
2.3 桑叶提取物黄酮提取率响应面回归模型的拟合程度（见表3）
由表3 可知提取因素对桑叶黄酮提取率的响应面模型显著（P<0.05），说明自变量与因变量与响应面模型拟合程度良好，其中时间和料液比因素的交互项显著影响桑叶黄酮提取率（P<0.05），时间因素的二次项极显著影响桑叶黄酮提取率（P<0.01），其他的交互项对黄酮的提取率没有显著影响（P>0.05）。
2.4 双因素交互项对桑叶提取物黄酮提取率的影响（见图6～图11）
三维响应面图和等高线图解释了黄酮提取率与所涉及的4 个提取参数之间的关系。在交互项对桑叶黄酮提取率的影响中，时间与料液比之间交互作用明显，表现为曲线最陡，响应值变化较大（图6）；温度和料液比之间交互有一定的效应，曲线有一定坡度（图7）；乙醇浓度与料液比（图8）、温度和时间（图9）、乙醇浓度与温度（图10）以及乙醇浓度与时间（图11）的交互作用较小，曲线较为平滑，响应值变化较小，结果与表3模型分析结果相吻合。
图6 料液比与提取时间对桑叶黄酮提取率的影响
图7 温度与料液比对桑叶黄酮提取率的影响
图8 乙醇浓度与料液比对桑叶黄酮提取率的影响
图9 时间与温度对桑叶黄酮提取率的影响
图10 温度与乙醇浓度对桑叶黄酮提取率的影响
图11 时间与乙醇浓度对桑叶黄酮提取率的影响
表3 桑叶提取物黄酮提取率回归模型的方差分析结果
2.5 桑叶提取物DPPH自由基清除活性（见表4）
由表4 可知，在3×10-4mol/L DPPH 浓度下，第17试验组的DPPH 自由基清除活性最高，为99.09%；第14 试验组最低，为43.13%。DPPH 自由基清除活性可以良好地体现样品的抗氧化性能，DPPH 自由基清除活性随着料液比的减少呈现先增高后降低的趋势。DPPH 自由基清除活性随着乙醇浓度增加呈现先增高后降低的趋势，与Radojkovic 等[15]的研究有相同的结果。在Prasad 等[16]的研究认为更高的乙醇浓度可以使蛋白质被凝固，和一些脂质化合物也可能被提取，所以过高的乙醇浓度可能会降低抗氧化分子得率的降低，造成DPPH自由基清除活性在升高的情况下降低。DPPH自由基清除活性随着提取温度增加呈现先增高后降低的趋势。DPPH自由基清除活性随着提取时间增加同样呈现先增高后降低的趋势。提取时间的增长增加了植物与溶剂的接触时间，能够让抗氧化分子更高效率地从植物内部释放到溶剂中，增加提取物的抗氧化性能，但是过长时间的高温环境，会影响植物细胞膜上受体蛋白的变性，降低其通透性，减少分子进出细胞膜的效率，导致溶剂中抗氧化分子含量的降低、DPPH自由基清除活性的降低[17]。
表4 桑叶提取物DPPH自由基清除活性的试验结果
2.6 响应面试验模型的验证
响应面模型优化桑叶黄酮提取条件为乙醇浓度54.75%、提取时间17.61 min、料液比1∶30.24（g/mL）、提取温度50.27 ℃时桑树黄酮最高得率为3.64%。选择提取时间17 min、提取温度为50 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度55%条件进行验证，结果黄酮提取率为3.62%、提取物DPPH 自由基清除活性为99.12%，黄酮提取率与理论值相对偏差为0.55%。
3结论
超声波辅助能够有效的提高桑叶黄酮提取率，乙醇浓度、提取时间、料液比和提取温度均影响桑叶黄酮的提取率。响应面模型优化的提取条件为乙醇浓度54.75%、提取时间17.61 min、料液比1∶30.24（g/mL）和温度50.27 ℃，此条件下桑叶黄酮的提取率最高，为3.64%。考虑到生产的实用性和方便性，选择提取条件为，时间17 min、温度50 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度55%，此条件下桑叶黄酮提取率为3.62%、提取物DPPH自由基清除活性为99.12%，与理论桑叶黄酮提取率相对偏差为0.55%，可以作为桑叶黄酮作为抗氧化剂开发利用的提取工艺。
