紫花苜蓿幼苗光合荧光特性对盐分胁迫的响应

王文静 麻冬梅 赵丽娟 苏立娜 李嘉文

(宁夏大学西北土地退化与生态系统恢复省部共建国家重点实验室培育基地/西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室，宁夏 银川 750021)

盐碱土是我国西北地区分布最广的土壤类型之一，面积约占陆地总面积的25%。宁夏银北地区盐碱地面积较大，随着人口增长与耕地面积减少的矛盾日益突出，宁夏回族自治区政府对于银北地区盐碱地的开发和利用高度重视[1]。近年来，为了在银北地区发展盐土农业，高效利用盐碱地，紫花苜蓿已成为该地区广泛种植的牧草作物之一，种植面积接近4×105m2[2]。光合作用是植物生长发育的物质和能量基础，约90%的植物生物量来自于光合反应过程[3]。然而，光合作用对盐胁迫非常敏感，盐胁迫通过卡尔文循环降低NADPH的消耗，抑制叶绿素合成和Rubisco活性，破坏光合电子传递[4]。深入理解盐胁迫对不同农作物光合反应效率影响的潜在机理，对于筛选耐盐作物品种和提高盐渍土栽培农作物产量具有重大意义。近年来，关于植物对盐胁迫的响应方面开展了大量的研究。结果表明，盐分胁迫会诱导植物体内某些结构和功能发生变化，进而影响植物的光合生理特性，维持光合作用的能力是判断植物是否耐盐的重要指标之一[5]。叶绿素荧光参数作为联系光合作用和环境关系的内在指标，广泛应用于植物抗逆性研究中[6]。目前，盐胁迫对不同植物光合生理的研究主要集中在粮食作物[7-11]、蔬菜作物[12]和木本植物[13,14]上，而对西北盐碱地区草本植物的报道相对较少。因此，探究盐胁迫下紫花苜蓿光合荧光特性，对于了解紫花苜蓿的耐盐机制，促进盐渍土地的有效利用，实现紫花苜蓿高产稳产具有重要的理论意义和实践价值。本研究以2个不同品种紫花苜蓿幼苗为试验材料，揭示盐胁迫与光合作用及相关指标之间的关系，为宁夏银北地区盐碱地开发利用，发展优质牧草产业提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本研究以预实验挑选出的极度敏盐品种“国产”和极度耐盐品种“阿迪娜”为试验对象，试验材料均来自于宁夏大学种质资源库。于2019年5—9月在宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室人工气候室(N38°30′，E106°8′)进行试验。苜蓿种子用0.1% HgCI2消毒8min，然后用75%酒精消毒30s，再用蒸馏水漂洗5～6遍，将清洗消毒之后的种子均匀铺在放好滤纸的培养皿中，并将滤纸用蒸馏水喷湿，放入人工培养箱培养至种子发芽(温度控制在26℃)。待幼苗长至2叶1心时移至装有3L Hoagland，s营养液的水培箱进行培养，每3d更换1次营养液。在营养液中培养30d后开始处理。NaCl直接加入水培液中，以便根系直接吸收减少误差。幼苗生长到3～4片真叶时，开始进行NaCl盐分胁迫，盐溶液浓度分别为40mmol·L-1、80mmol·L-1、120mmol·L-1和160mmol·L-1，用M1、M2、M3、M4来表示。以浇灌营养液作为对照(M0)，每个处理3个重复。胁迫15d后，选取全展开叶测定单株的光合指标。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 生长及生理指标测定

采用卷尺进行株高的测定，游标卡尺测定其茎粗。每个胁迫处理分别随机选取长势一致的5株测定株高、茎粗和叶面积等生长指标。采用北京澳作生态仪器有限公司便携式叶绿仪FK-YL02测定SPAD含量。植物样品收获后，用去离子水将植株冲洗3次，分成根、茎、叶3部分，置于105℃烘箱中杀青30min，转至85℃烘至恒重，并称取其干质量，得到各器官生物量，并计算根冠比。

1.2.2 光合指标测定

1.2.2.1 仪器

采用天津瑞暄科技发展有限公司发布的便携式光合作用仪Li-6400XT。

1.2.2.2 具体方法

每个胁迫处理选取长势相近的植株5株，重复3次，测定部位为倒2叶。先将叶片在光合有效辐射1500μmol·m-2·s-1、温度(28±2)℃、空气相对湿度40%～50%条件下诱导30min以上，待净光合速率和气孔导度相对稳定后开始测定各项指标。

1.2.3 叶绿素荧光参数的测定

1.2.3.1 仪器

采用北京澳作生态仪器有限公司的便携式叶绿素荧光仪OS5p+。

1.2.3.2 具体方法

每个胁迫处理取长势相近的植株3株，重复3次，测定部位为倒2叶。暗处理30min后开始测定叶片基础荧光(Fo)、最大荧光(Fm)和PSII最大光化学转换效率(Fv/Fm)。自然光下活化30min后，测定最小荧光Fo′、最大荧光Fm′、稳态荧光Fs。

1.3 数据分析

利用Excel 2010软件进行数据处理分析，利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和多重比较(LSD<0.05)，利用R软件进行相关性分析和驱动力分析，采用Origin 2018软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗生长的影响

如图1所示，与M0处理相比，M1胁迫处理对“国产”幼苗的株高、基径和叶面积增长产生了显著的抑制作用，其分别降低5.77%、20.13%和13.73%，M1与M2、M3、M4处理间无显著差异。M2处理对“国产”幼苗叶片的SPAD含量有明显抑制作用，较M0相比降低23.33%，M2与M3、M4处理间差异不显著。M1胁迫处理显著抑制了“国产”幼苗干物质量，根干重、茎干重、叶干重和总干重较M0处理相比分别降低15.97%、33.51%、10.47%和23.04%，以M4处理的幼苗干物质量最低。

随着胁迫强度的增加，“阿迪娜”幼苗地上部生长指标均表现为下降趋势，但各生长指标与M0处理间无显著性差异。盐胁迫对“阿迪娜”叶片SPAD含量无显著抑制作用。与M0处理相比，M2处理对“阿迪娜”干物质量的积累有显著降低趋势，根干重、茎干重、叶干重和总干重分别降低22.30%、30.61%、24.31%和25.88%，以M3处理的幼苗干物质量最低。M1处理与M0相比显著降低根干重，其降低16.22，对其它器官干重和总干重的影响不显著。与对照相比，M4处理对根冠比有显著促进作用，增加比例达24.24%，而与其它胁迫处理差异不显著。

2.2 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗光合特性的影响

2.2.1 净光合速率

不同胁迫处理下，“国产”和“阿迪娜”净光合速率随NaCl浓度的增加均呈下降趋势。以“国产”为例，M1、M2、M3和M4处理均与M0处理呈显著性差异，而M2与M3和M4处理间差异性不显著。M1处理较M0处理相比显著降低17.40%。“阿迪娜”幼苗叶片的净光合速率在盐胁迫处理(M1～M4)下,较M0处理分别降低14.62%、24.92%、44.08%和44.85%，其中M1和M2处理间差异不显著，M3和M4处理间差异不显著。M2处理下“阿迪娜”的净光合速率高于“国产”，存在显著性差异，其它盐浓度处理下两者比较均不显著。且在图中可以看出，M2处理时“国产”的净光合速率较M1下降趋势远远大于“阿迪娜”，也就是随着盐浓度升高对“国产”的影响大于“阿迪娜”，见图1a。

图1 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗叶片气体光合参数的影响

2.2.2 胞间CO2浓度

不同胁迫处理下，“国产”和“阿迪娜”叶片胞间CO2浓度随NaCl浓度的增加均呈上升的趋势，其中“国产”在M2处理时达最低值，“阿迪娜”在M3处理时达最低值。“国产”M1处理的胞间CO2浓度较M0相比差异不显著；而“阿迪娜”M1处理较M0相比呈显著性差异，其降低10.92%。M1和M3处理下“国产”胞间CO2浓度高于“阿迪娜”且差异显著，M2处理时相反，“阿迪娜”胞间CO2浓度高于“国产”，见图1b。

2.2.3 气孔导度

不同胁迫处理下，“国产”和“阿迪娜”叶片气孔导度随NaCl浓度的增加均呈下降趋势。其中，“国产”M2处理对气孔导度的抑制作用最强，较对照相比显著降低87.88%，M2与M3和M4处理间差异性不显著。M1处理较对照相比显著降低24.24%。“阿迪娜”M1处理的气孔导度较对照相比显著下降34.62%，M1处理与M3和M4处理呈显著性差异，见图1c。

2.2.4 蒸腾速率

不同胁迫处理下，“国产”和“阿迪娜”叶片蒸腾速率随NaCl浓度的增加均呈下降趋势，与净光合速率变化趋势一致。其中，“国产”在M2处理下达最低值，较M0处理相比降低81.47%，M2与M3和M4处理间差异不显著。M1处理较M0处理相比降低29.97%。而“阿迪娜”M1处理较对照相比下降26.42%，且M3和M4处理间呈显著性差异。以M2处理为界限，盐浓度低于80mmol·L-1时，“国产”蒸腾速率高于“阿迪娜”；80～160mmol·L-1时，“阿迪娜”蒸腾速率明显居高，说明随着盐浓度升高敏盐品种“国产”的蒸腾速率较低，而耐盐品种“阿迪娜”更容易适应盐胁迫条件生长，见图1d。

2.2.5 水分利用效率

不同胁迫处理下，“国产”和“阿迪娜”叶片水分利用效率随NaCl浓度的增加呈先升后降的趋势。“国产”和“阿迪娜”均在M2处理达到最大值，其最大水分利用效率分别为5.206μmol·mmol-1和3.407μmol·mmol-1，并且可以看出，在4个不同浓度的盐胁迫处理下“国产”的水分利用率均高于“阿迪娜”，见图1e。

2.2.6 气孔限制值

不同胁迫处理下，“国产”和“阿迪娜”叶片气孔限制值随NaCl浓度的增加呈先升后降的趋势。M2～M4处理的“国产”叶片气孔限制值显著高于M0和M1处理。“阿迪娜”盐胁迫处理的气孔限制值均显著高于对照，且M3与M1处理间呈显著性差异，见图1f。不同盐浓度胁迫处理下，“阿迪娜”的气孔限制值高于“国产”，只有在M2处理下“国产”气孔限制值反超“阿迪娜”。可以看出，不同盐胁迫处理对作物光合作用的影响具有一定差异，且会减少进入气孔的CO2，不能满足光合作用的要求影响作物生长。

2.3 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗叶绿素荧光特性的影响

如图2所示，盐胁迫下，2个品种紫花苜蓿幼苗叶片Fv/Fo和Fv/Fm均呈下降趋势。与对照相比，“国产”幼苗M1～M4处理的Fv/Fo显著下降8.08%、9.70%、7.16%和17.55%；而M4处理的Fv/Fm较对照相比显著下降14.29%。盐胁迫对“阿迪娜”幼苗叶片的Fv/Fo和Fv/Fm均无显著影响，见图2a、图2b。在M1～M3盐胁迫处理下，2个品种紫花苜蓿幼苗叶片ETR与对照相比无显著性差异；在M4盐胁迫处理下，“国产”幼苗叶片ETR较对照相比显著下降17.52%。“阿迪娜”幼苗叶片ETR较对照显著降低8.39%，见图2d。在M1胁迫处理下，“国产”幼苗叶片ΦPSII、qP、NPQ与对照相比差异性不显著；在M2～M4处理下，“国产”幼苗叶片qP和ΦPSII随着盐浓度的增大显著下降，而NPQ则随之显著上升。与对照相比，M4处理下“阿迪娜”幼苗叶片ΦPSII、qP显著降低26.87%、25.88%。盐胁迫对“阿迪娜”幼苗叶片NPQ无显著抑制作用，见图2c、图2e、图2f。

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图2 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗叶片荧光参数的影响

2.4 盐胁迫下紫花苜蓿幼苗生物量与光合参数相关性分析

如图3所示，“国产”和“阿迪娜”幼苗叶片总干重与SPAD含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率呈显著正相关关系，根冠比与SPAD含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率呈显著负相关关系；蒸腾速率和SPAD含量、净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度两两之间均呈显著正相关关系。

图3 盐胁迫下紫花苜蓿幼苗生物量与光合参数相关性分析

2.5 盐胁迫、叶绿素含量、光合参数对紫花苜蓿幼苗生物量变化的贡献

利用R软件里面的BioEnv程序包筛选出对“国产”和“阿迪娜”幼苗生物量变化具有显著影响的光合参数为净光合速率(Pn)和SPAD含量，再通过方差分解分析(VPA)可得出盐胁迫与光合参数以及二者共同作用对“国产”和“阿迪娜”幼苗变化的贡献，如图4所示。盐胁迫(Ss)、Pn和SPAD含量以及三者之间交互作用解释幼苗生物量变异的比例为44.3%。对于单个因子来说，Ss、Pn(P=0.155)；Ss与Pn共解释幼苗生物量变化的比例为7.24%(P=0.001)，Pn与SPAD含量共解释幼苗生物量变化的比例为13.2%(P=0.001)，Ss与SPAD含量共解释幼苗生物量变化的比例为-0.27%(P=0.001)，3个因子共解释幼苗生物量变化的比例为23.67%(P=0.001)。

图4 紫花苜蓿幼苗生物量变化的驱动力分析

3 讨论

3.1 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗生长和生物量变化的影响

生物量是评估盐胁迫程度和植物抗性的可靠指标[17]。相关研究表明，盐胁迫条件下植物生长会产生抑制作用，且盐胁迫程度越高，受抑制现象越明显[18]。就盐生植物而言，当盐胁迫程度没有超过生长临界值时，同化作用不会被抑制，甚至较低的盐浓度会促进植物生长[19]。本文研究发现，不同浓度盐胁迫处理下，“国产”幼苗株高、基径、叶面积及生物量均显著低于对照，而“阿迪娜”的生长指标与对照相比有下降趋势，但无显著性差异，见表1。可见，“国产”苜蓿品种在盐胁迫条件下表现出较强的敏盐性。“阿迪娜”幼苗茎叶干重和总干重在M1处理中与对照相比差异性不显著，而根干重随着盐胁迫程度的加剧显著下降，见表1，说明根干重在盐胁迫条件下表现出较强的敏盐性。然而盐胁迫对“国产”和“阿迪娜”的影响机理不同。就本研究结果而言，“阿迪娜”比“国产”的耐盐性更强，40mmol·L-1(M1)的盐浓度可能更适合“阿迪娜”生长发育，而160mmol·L-1(M4)的盐浓度可能为“国产”和“阿迪娜”的最大耐盐临界值。

表1 盐胁迫下紫花苜蓿幼苗生长指标变化

根冠比能够表征光合产物在生物量中的分配方式[20]。本试验结果表明，“国产”和“阿迪娜”幼苗的根冠比随着盐胁迫程度的增加而增加，高盐胁迫处理的根冠比显著高于对照，见表1。且“国产”的根冠比值较大于“阿迪娜”，表明盐胁迫条件下，“国产”幼苗根系扩散能力较快，分配到的同化产物远高于地上部。可见，“国产”增加生物量在根系的分配有利于获取更多的水分和营养，从而增强植物的生长能力，也稀释了细胞内的盐分[21]。这一结论与郭丽丽等[12]针对番茄的研究结果不一致，其原因可能是紫花苜蓿和番茄2种植物在逆境盐胁迫条件下改变生物量的分配模式存在一定差异。

3.2 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗光合参数变化的影响

叶绿素含量的变化可直接或间接反映植物叶片光合能力的强弱，是评价植物耐盐程度的重要生理指标[22]。本文研究表明，“国产”的SPAD含量随着盐浓度的增加呈显著下降趋势；低浓度胁迫处理能使紫花苜蓿幼苗SPAD含量略增加，且“阿迪娜”的增幅较大，见表1。这一结果与孙璐等[9]针对高粱作物的研究结论一致。而盐胁迫条件下“阿迪娜”SPAD含量变幅微小，可见其对盐胁迫敏感性程度不明显。

盐胁迫对“国产”和“阿迪娜”幼苗叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)产生显著抑制作用，见图1，这与前人研究结果相似[9-12]。并且盐胁迫下，“阿迪娜”光合参数下降幅度低于“国产”，说明“阿迪娜”具有较强的耐盐性。盐胁迫条件下，气孔限制和非气孔限制2个因素会对植物的光合作用产生显著的影响[23]。王庆辉等[24]研究表明，盐胁迫会破坏根系质膜，引发渗透胁迫，阻碍水分吸收和养分吸收并降低植物进入叶肉细胞的CO2速率，从而导致光合作用减弱，认为光合速率下降是由气孔因素所限制[25]；而Yang等[26]研究表明，盐胁迫引发光合速率降低主要是RuBP羧化酶效率降低和光合作用表观量子效率下降，认为是非气孔因素所限制。本文研究表明，盐胁迫下“国产”和“阿迪娜”叶片Pn下降，Gs降低，限制了CO2向叶绿体的运输。当盐浓度在40～80mmol·L-1时，胞间CO2浓度(Ci)随Gs的减小而降低，气孔限制值(Ls)增加，Pn降低，见图1。引发这一现象的原因可能是盐胁迫会破坏根系质膜，引发渗透胁迫，阻碍水分吸收和养分吸收并降低植物进入叶肉细胞的CO2速率，从而导致Ci降低。由此表明，当盐浓度在80mmol·L-1时，“国产”和“阿迪娜”幼苗叶片Pn下降是由气孔因素限制，这与前人针对葡萄的研究结果是一致的[27]。“国产”和“阿迪娜”幼苗叶片Gs值随着盐胁迫程度的加剧呈缓慢下降的趋势，但Ci却呈上升趋势，Ls逐渐降低，见图1。产生这一现象的原因可能是高浓度NaCl胁迫可短时间内增强细胞呼吸作用，使盐离子大量累积，破坏了叶绿体结构，造成叶片光合器官的损伤和叶肉细胞的光合活性下降，说明此时光合速率降低的主要原因是非气孔限制。综合以上2点可以看出，随着盐胁迫程度的加剧“国产”和“阿迪娜”幼苗光合作用限制均由最初的气孔制约逐渐转向非气孔制约，但抑制光合作用的盐浓度有所区别，“国产”为M2盐胁迫水平，而“阿迪娜”则为M3盐胁迫水平，进一步证实2个品种紫花苜蓿对盐分敏感程度不同。

水分利用效率(WUE)是植物光合同化效率和水分散失的综合反映[28]。有研究表明，盐胁迫条件下葎草幼苗叶片WUE呈上升趋势[29]，刺槐幼苗叶片WUE呈降低趋势[30]；另有研究发现，不同白榆品系的叶片WUE呈现先增后减的趋势[31]。可见，盐胁迫对植物叶片水分利用效率的影响有许多报道，但结论并不一致。本研究结果表明，盐胁迫导致“国产”幼苗叶片WUE呈先增后减的趋势，而“阿迪娜”叶片WUE呈上升趋势，见图1e。表明本试验采用的2个紫花苜蓿品种幼苗的WUE变化趋势不同，可能与自身遗传特性有关，如形态结构、同化方式、气孔调控方式、适应与保护机制、物质同化积累与分配模式等[32]。然而具体原因有待于进一步研究。有研究表明，盐胁迫条件下保持较高的WUE不仅能满足自身生长，又能避免逆境带来的伤害，从而起到主动调节作用，表现出高度适应性[33]。本研究中2个品种幼苗的WUE均在M2处理下达到最大值，表现出较强的适应性。

3.3 盐胁迫对紫花苜蓿幼苗荧光参数变化的影响

叶绿素荧光参数对盐胁迫的响应非常敏感，在反映光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、分配、耗散和转换方面具有独特的作用[34]。本文研究发现，在高盐浓度胁迫下，“国产”幼苗叶片Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qP均有所下降，而NPQ显著高于对照，见图2，说明高盐胁迫条件下“国产”叶片光系统Ⅱ的激发能分配方式受到了影响，而且越来越多的吸收光能通过非光化学的途径被耗散来适应盐胁迫环境。“阿迪娜”幼苗叶片Fv/Fo和Fv/Fm在各浓度盐胁迫处理间差异不显著，而其它参数值在高盐处理下均出现不同程度的降低，见图2，说明盐胁迫能使“阿迪娜”有效保持Fv/Fo和Fv/Fm，使光合机构趋于稳定，防止Pn过度下降，这可能是“阿迪娜”幼苗叶片的自我保护机制。

叶绿素作为光合色素中的重要色素分子，不仅能够摄取外界光源保证植物叶片顺利进行光合作用，而且是反映植物叶片光合能力大小的重要光合生理参数[22]。本研究表明，叶片SPAD含量与光合特征参数均呈显著正相关，见图3，这与前人在2种菠萝蜜属植物上的研究结论一致[11]。光合作用是作物生长发育过程中影响干物质积累的重要环境因子[35]。本文结果表明，紫花苜蓿幼苗总干重与SPAD含量及光合参数呈显著正相关，见图3，进一步证实了作物生长过程中增加叶片光合水平和保持较高的SPAD含量有利于促进植株干物质量的积累。盐胁迫可显著影响紫花苜蓿幼苗SPAD含量、Pn和生物量。方差分解分析表明，盐胁迫、SPAD含量和Pn二者及三者之间交互作用解释幼苗生物量变异的比例均达显著性。其中三者交互作用影响最大，见图4。因此，2个品种紫花苜蓿幼苗生物量随着盐胁迫水平的提高而降低，与SPAD含量等光合特征参数的降低存在密切关系。

4 结论

盐胁迫使“国产”和“阿迪娜”叶片的光合参数降低，且“国产”的下降幅度显著大于“阿迪娜”。产生这种现象的原因主要是“国产”和“阿迪娜”幼苗随着NaCl胁迫水平的增加，光合作用减弱，由最初的气孔制约逐渐转向非气孔制约。高浓度盐胁迫对“国产”幼苗叶片Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qP产生显著抑制作用，而NPQ随着盐胁迫的增强表现出先升高后降低的趋势。说明高浓度NaCl胁迫会对“国产”幼苗光系统Ⅱ活性和光能转换效率产生抑制作用，因此可通过增加光系统Ⅱ非辐射能量的耗散来适应盐胁迫环境，而“阿迪娜”在耐盐适应性方面较优于“国产”苜蓿。总体而言，光合荧光特征参数可作为快速判断紫花苜蓿幼苗耐盐程度的重要指标。