青海省野生犬科动物棘球绦虫感染状况调查及防控研究

黄 荣，朵 红，沈秀英，付 永，张学勇，马怡隽，陈有录，郭志宏

(青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016)

位于青藏高原北部的青海省由于其特殊的地理位置和气候环境条件是人畜共患包虫病的高发流行地区，也是世界上棘球蚴病流行最严重的地区[1]，棘球蚴病严重威胁着畜牧业的发展和广大牧民群众的身心健康。青藏高原存在着细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫3种棘球绦虫，其宿主为犬和野生犬科动物(主要是狐狸和狼)。犬是最重要的终末宿主和传染源[2-4]，犬棘球绦虫的感染率高达64.56%[5]，在2012—2016年中国棘球蚴流行区犬粪棘球绦虫抗原检测调查中，青海省的感染率最高[6]。近年来，青海省政府在全省实施了“月月投药，犬犬驱虫”的措施，有效控制了家养犬、人及家畜棘球绦虫及棘球蚴的感染。但由于棘球蚴病的传播，尤其在多房棘球绦虫和人泡性包虫病的传播中，野生犬科动物狐狸是公认的最易感染多房棘球绦虫的宿主。野生犬科动物，主要捕食各种啮齿类动物，并且狐狸是犬科动物中活动范围最广的一类动物，所以狐狸也是多房棘球绦虫重要的终末宿主[7]。瑞士和波兰随着赤狐数量的增加，人群中泡性包虫病(AE)的新增病例不断上升[8-9]。有关青藏高原野生犬科动物棘球绦虫感染调查的报道很少，尤其是针对野生狐狸棘球绦虫的防控研究未见报道。本研究通过对野生犬科动物的粪便检查和动物剖检，调查了青海省部分地区野生犬科动物棘球绦虫的流行病学。2014年2月至2018年7月通过对野生狐狸洞穴周边粪便调查及驱虫，探索了野生狐狸棘球绦虫的防控方法，为野生动物包虫病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 野外动物粪便收集

在青海省海北藏族自治州海拔高度3 000～4 000 m的祁连县和海晏县，青海南部海拔4 000 m以上的玉树藏族自治州称多县和果洛藏族自治州达日县，野外采集疑似野生动物粪便样品160 份。-80 ℃冰箱保存2周以上，让棘球绦虫虫卵失活，用蔗糖漂浮法做粪便虫卵检查[10]。

1.2 动物剖检

从2014年2月至2018年7月分别收集了祁连、海晏、称多、达日4县的狐狸尸体共67只，从称多县收集狼肠道1副。收集到的材料在-80 ℃冰箱保存2周以上，让棘球绦虫虫卵失活。剖检时进行编号，採取部分肌肉或肝脏用于动物种类鉴定。分段剪取胃肠，翻洗沉淀后收集虫体并逐条计数、登记。用PBS 液清洗收集，75%乙醇固定、保存，并进行虫种鉴定。

1.3 动物种类鉴定

将野外收集的疑似狐狸和狼粪便，在冷冻状态下用ASL缓冲液(QIAamp DNA Stool Mini Kit，Qiagen)按文献[11]报道的方法进行冲洗，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen)提取粪便表面的宿主DNA。对剖检动物的肌肉或肝脏用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Tokyo，Japan)试剂盒提取DNA。以上提取的DNA在D-loop领域用哺乳动物通用引物 prL(5′-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3′)和prH(5′-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3′)进行扩增[11]，扩增后的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收产物送上海生工生物工程技术有限公司测序。

1.4 虫体和虫卵DNA鉴定

将野外收集的动物粪便内的虫卵，按形态进行分类，分别取20～40个虫卵用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Tokyo，Japan)试剂盒提取DNA。动物肠道内的虫体也按形态进行分类，分别採取部分虫体用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取DNA。对收集的绦虫在线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(CO1)领域，用绦虫通用引物2575(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)和 3021(5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′)进行扩增[12]，对其他虫种在ITS2领域，用 LC1(5′-CGAGTATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和HC2(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGG-3′)引物进行扩增[13]，扩增后的产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送上海生工生物工程技术有限公司测序。

1.5 驱虫试验

1.5.1 驱虫药物

艾普锐克吡喹酮咀嚼片(北京中农华威制药股份有限公司生产，批号为20161013)。

1.5.2 方法

分别在3处狐狸窝两边5～6 m的位置，挖长15～20 cm，高10 cm，深6～9 cm的小洞投放带诱食剂的驱绦虫药物吡喹酮，第一次用少量的羊肉包裹驱虫药，3 d后进行第二次投放驱虫药，投药方法同前。第二次投药10 d后收集周边狐狸粪便进行棘球绦虫虫卵检查，以后在投药6个月、1年、2年的时候收集周边狐狸粪便进行虫卵检查。

2 结果与分析

2.1 野外动物粪便检查

野外收集到160份疑似犬科动物粪便，经DNA鉴定，53份为野生犬科动物粪便，其中9份为红狐粪便(同源性一致率达98%～100%，GenBank ID：AB292754)，24份为藏狐粪便(同源性一致率达99%～100%，GenBank ID：JF520840)，13份为沙狐粪便(同源性一致率达97%～100%，GenBank ID：KJ140137)，7份为狼粪便(同源性一致率达99%～100%，GenBank ID：KY996529.1)；从53份粪便中检查出19份感染6种寄生虫，包括4种绦虫、1种蛔虫和1种吸虫，详见表1。

表1 野生犬科动物粪便虫卵检查结果表

由表1可知，53份粪便样品中检出狮弓首蛔虫10份，感染率高达18.87%(10/53)，有翼翼形吸虫和带状带绦虫的感染率为5.7%(3/53)，称多县採集的9份藏狐粪便中，2份检出石渠棘球绦虫虫卵。多房棘球绦虫的感染率为11.3%(6/53)，其中7份狼粪便中3份为阳性，说明野生犬科动物粪便中多房棘球绦虫的感染率较高，会造成环境污染。

2.2 动物剖检及寄生虫检查

剖检了67只狐狸，经DNA鉴定，33只为红狐、25只为藏狐、9只为沙狐，检查狼肠道1副。动物种类和肠道寄生虫感染情况见表2。

表2 野生犬科动物种类及肠道蠕虫感染调查结果表

由表2可知，剖检的67只狐狸中，海晏县有红狐29只、藏狐8只，祁连县9只均为沙狐，达日县4只均为红狐，称多县17只均为藏狐。67只狐狸中有60只感染8种寄生虫，感染率为89.55%(60/67)，狼的小肠内发现101条线中绦虫(Mesocestoideslitteratus)。线中绦虫和狮弓首蛔虫为野生犬科动物肠道寄生虫的优势虫种，感染率最高达61.76%(42/68)和36.76%(25/68)，有翼翼形吸虫的感染率也达17.65%。玉树州剖检的17只藏狐中，6只感染石渠棘球绦虫。多房棘球绦虫的感染率为13.24%(9/68)，藏狐、红狐和沙狐均有感染。海晏县和称多县的藏狐中发现多头绦虫。

2.3 驱虫药物投放前后狐狸粪便检查

药物投放前分别在3处野生狐狸窝周边收集了37份疑似狐狸粪便，经宿主鉴定11份为藏狐粪便。从11份粪便中发现狮弓首蛔虫、多房棘球绦虫和带状带绦虫3种寄生虫虫卵。第二次投药后6个月的检查中又发现有翼翼形吸虫卵，1年后粪便中再次出现多房棘球绦虫虫卵(表3)。

表3 根据粪便DNA确定动物种类和粪便虫卵检查

3 讨论与结论

据报道，青海省生息着藏狐和红狐2种狐狸[14]，但本研究中，通过形态学和DNA鉴定认为青海省分布着红狐、藏狐和沙狐3种狐属动物，这和冯祚建和龚明昊的报道一致[15-16]。剖检的67只狐狸，其中60只感染8种寄生虫，感染率为89.55%(60/67)，在收集到的一份狼小肠内发现101条线中绦虫(Mesocestoideslitteratus)，说明青藏高原野生犬科动物寄生虫的感染率和感染强度很高。其中线中绦虫和狮弓首蛔虫的感染率最高，分别为 61.76%(42/68)和36.76%(25/68)，是青海省野生犬科动物肠道蠕虫的优势虫种。线中绦虫的感染率高是由于野生狐狸和狼主要捕食中间宿主的小型啮齿类动物引起的感染。在收集的粪便虫卵检查中未发现线中绦虫虫卵，这可能是由于许多线中绦虫卵在成虫副子宫器内外层形成一个包囊，随粪便排出的虫卵也包裹在包囊之中，不易检出。另外，一般的绦虫卵也是随孕节脱落排出体外，这就决定了虫卵检查的局限性。家养犬用吡喹酮驱虫后再检查粪便，能大大提高绦虫卵的检出率[17]。在狐狸肠道和粪便虫卵检查中检出了多头绦虫及虫卵，牛羊等反刍动物是多头绦虫的中间宿主，多头蚴主要寄生在脑部，引起牛羊运动机能失调影响采食，最后导致死亡。野生狐狸可能在草原上采食了感染多头蚴的牛羊脑部感染了多头绦虫。

青海省海北、果洛、玉树藏族自治州野生狐狸和狼均有多房棘球绦虫感染，粪便检查和动物解剖检查中狐狸的感染率为11.3%和13.42%，经SPSS 19.0数据分析软件进行单因素对比分析，两种检查结果差异不显著(P>0.05)，说明用粪便检查的方法能够代表剖检法进行野生犬科动物棘球绦虫的感染调查。同时，在本次调查中狼粪便中也发现多房棘球绦虫虫卵，狼作为包虫病的终末宿主，在包虫病传播中也是不可忽视的传染源。本次调查仅仅在称多县的藏狐中发现石渠棘球绦虫，石渠棘球绦虫是否有一定的终末宿主选择性，有待进一步研究。

野生狐狸棘球绦虫防控试验中，使用吡喹酮咀嚼片驱虫前在狐狸粪便中检出多房棘球绦虫虫卵，表明该地区野生狐狸小肠内寄生多房棘球绦虫。在投药后的6个月内粪便中未检出多房棘球绦虫虫卵，说明该药物有良好的驱虫效果，可以作为野生狐狸棘球绦虫的防控药物使用。驱虫1年后又重新检出该虫卵，说明野外存在重复感染，应该定期进行投药驱虫。

随着生态环境的逐步改善和人民群众对动物保护意识的提高，青藏高原野生动物数量不断增加。野生狐狸和狼的活动区域越来越接近人们的生活范围，通过野生犬科动物传播包虫病的风险日趋严重，应引起足够重视。